氨基葡萄糖微生物合成研究进展

氨基葡萄糖简称氨糖,是葡萄糖的一个羟基被氨基取代后的产物.氨基葡萄糖与其代谢产物乙酰氨基葡萄糖广泛应用于食品、化妆品以及医药行业.随着生物技术的发展,氨基葡萄糖的生产方式由传统的酸解几丁质法转变为微生物发酵法.文章介绍了近年来利用微生物发酵法生产氨基葡萄糖时使用的基因工程技术手段与代谢途径的理性设计方法,讨论了氨基葡萄...     

微生物法合成N-乙酰氨基葡萄糖及其衍生物的研究进展

氨基葡萄糖(glucosamine, GlcN)是葡萄糖2位碳上的羟基被氨基取代后的氨基单糖。GlcN及其衍生物N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)在食品、医药和化妆品领域具有广泛应用。文章综述了生物法生产N-乙酰氨基葡萄糖及其衍生物代谢工程策略的研究进展,并对其潜在问题及应用前景进行了展望。     

邻苯二甲醛柱前衍生法测定食品中盐酸氨基葡萄糖的含量

目的：建立邻苯二甲醛(OPA)柱前衍生法测定食品中盐酸氨基葡萄糖含量的分析方法。方法：取样品加入约40 mL水，超声处理30 min，用水定容至50 mL，用0.45μm滤膜过滤，经SHIMAZDU ODS-SP(4.6 mm×150 mm,5μm)分离，以0.68%醋酸缓冲液:甲醇(80:20,v:v)为流动相等度洗脱，流速1.0 mL/min，柱温35℃，进样量5μL，二极管阵列检测器340 nm波长采集数据，外标法定量。结果：盐酸氨基葡萄糖在10～1000 mg/L浓度范围内线性良好，相关系数R2为0.9995,3个浓度水平的加标回收率在91.1%～95.60%，相对标准偏差(n=6)为0.84%～1.10%，精密度的相对标准偏差(n=6)为0.61%，方法检出限为0.0050 g/100 g，定量限为0.0125 g/100 g。结论：该方法操作简便、灵敏度高，具有良好的准确度和精密度，适用于食品中盐酸氨基葡萄糖含量的测定。     

通过解除磷酸糖胁迫提高枯草芽孢杆菌N-乙酰氨基葡萄糖合成能力

N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine, GlcNAc)在食品、保健品以及药品领域有着广泛的应用。该课题组前期构建了一株具有较高GlcNAc合成效率的枯草芽孢杆菌底盘细胞FMIK,由于GlcNAc前体的过量积累引起了磷酸糖胁迫，限制了FMIK的GlcNAc产量。因此，该文首先通过实施荧光定量PCR验证磷酸糖胁迫对于glcR-ywpJ操纵子转录水平影响，并通过凝胶迁移率确定GlcR与P_glcR的结合能力；然后，利用易错PCR构建P_glcR-ep突变体库，设计并使用基于荧光检测的高通量筛选系统，鉴定得到P_glcR与GlcR结合的关键区域；最后，在FMIK菌株的基础上对筛选得到的P_glcR与GlcR的结合关键区域进行敲除，得到工程菌株FMIK-m4。该菌株有效降低了GlcNAc前体浓度，解除了磷酸糖胁迫导致的二次生长现象，且摇瓶内GlcNAc产量提高至18.21 g/L。     

分散泛菌胞内脱乙酰酶在大肠杆菌中重组表达条件优化及酶学特性

目的 对分散泛菌的胞内脱乙酰酶(Pantoea dispersa N-acetylglucosamine deacetylase, Pd-nagA)进行表达条件优化及酶学性质分析。方法 本研究使用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术对分散泛菌全基因组中Pd-nagA基因序列进行全长扩增，将含有Pd-nagA基因的质粒pET-28a(+)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，同时采用单因素实验，优化诱导温度、诱导前菌体生物量、诱导时间以及乳糖类似物异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)的浓度，采用Ni2+-次氮基三乙酸(nitrilotriacetic acid，NTA)进行重组酶的纯化，再对其酶学特性进行测定。结果 以pET-28a(+)质粒作为表达载体，大肠杆菌BL21(DE3)成功表达了可溶形式的Pd-nagA蛋白，分子量约为40 kDa。当诱导温度为28℃，诱导前菌液OD600值为1.2，IPTG浓度为0.6 mmol/L，诱导时间为20 h时，Pd-nagA蛋白得到了大量表达。通过薄层层析法分析表明Pd-nagA重组蛋白能够在体外转化N-乙酰氨基葡萄糖生成氨基葡萄糖，Pd-nagA重组蛋白能够在高盐溶液中保持一半的相对酶活性，该酶储存10 d的相对活性仍然保持在90%以上，具有良好的储存稳定性，催化N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine, GlcNAc)生成氨基葡萄糖(glucosamine, GlcN)反应条件简单快捷。结论 本研究成功异源表达了具有催化活性的Pd-nagA酶，并对表达条件进行优化及酶学特性探究，可为工业上单酶催化制备氨基葡萄糖提供一定的理论参考。     

人体线粒体N-乙酰氨基葡萄糖转移酶在酿酒酵母中的表达

O-GlcNAc是一种广泛存在于蛋白质丝/苏氨酸残基上的动态可逆的蛋白质翻译后修饰方式,广泛分布在细胞浆和细胞核中,参与调节多种细胞途径。蛋白质的O-GlcNAc糖基化与许多疾病密切相关,如糖尿病、神经退行性疾病和癌症等。在体内,O-GlcNAc动态修饰由N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(OGA)协同完成。OGT具有3种异构体,分别是ncOGT、mOGT和sOGT。目前对于mOGT的功能和调节机制尚未清楚。作者在酿酒酵母细胞中表达了人源的mOGT,发现mOGT抑制酵母细胞的生长。在酿酒酵母细胞中mOGT具有O-GlcNAc糖基化活性,当其活性位点突变后,O-GlcNAc糖基化活性明显降低,但其同样能抑制酵母细胞生长。作者在酿酒酵母细胞中构建了研究mOGT的系统。可以利用该人源化的酵母筛选和mOGT相互作用的蛋白质和基因,也可以用来筛选抑制mOGT活性的药物,进而研究mOGT的功能与调节机制。     

甲壳素及其衍生物的制备与抑菌活性研究

对从龙虾废弃物制备的甲壳素、壳聚糖及其衍生物甲壳低聚糖、氨基葡萄糖盐酸盐对3种G-菌与3种G+菌的抗菌活性进行了研究。MIC试验结果表明甲壳低聚糖、氨基葡萄糖盐酸盐对所有测试菌株的MIC均0.01%,比甲壳素、壳聚糖表现出更高的抑菌活性。通过绘制生长曲线,对4种物质的抑菌活性进行研究,结果表明0.1%的壳聚糖能抑制64%的枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌,说明杆菌属对壳聚糖比较敏感,甲壳低聚糖对G+菌都表现出较强的抑菌作用,氨基葡萄糖盐酸盐能完全抑制金黄色葡萄球菌的生长。甲壳素和壳聚糖对G-大肠杆菌、绿脓假单胞菌有一定的抑制作用,对沙门氏菌基本没有抑制作用。0.1%的甲壳低聚糖与氨基葡萄糖盐酸盐对几种G-菌的抑制作用较强。甲壳素和壳聚糖可作为较有效的抑菌剂,甲壳低聚糖与氨基葡萄糖盐酸盐可作为几种受试G-菌的杀菌剂。