人工诱导牙鲆异质雌核发育群体的微卫星标记分析

采集牙鲆成熟精、卵,通过紫外线照射精子和冷休克处理受精卵,经形态学和染色体计数检测获得了异质雌核发育牙鲆群体,采用筛选获得的10对高多态性的微卫星引物对该群体进行了遗传变异分析。结果为：10对引物中,Po91可能因为出现了无效等位基因而没有扩增产物,其余9对引物全都扩增出目的片段,其中7对表现出多态性,其多态座位比例为77．8％,平均杂合度为0．3856,明显低于自然和养殖群体;在具多态性的7个基因座位上均发生了基因一着丝点之间的重组,重组率在42．6％～100％之间。通过抑制第二极体排出获得的牙鲆雌核发育群体在个体和群体水平尚具有一定的基因杂合。     

反相液相色谱-串联质谱法筛选牙鲆鱼蛋白质中潜在的过敏原

目的建立反相液相色谱-串联质谱法(reversed phase liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry, RPLC-MS/MS)筛选牙鲆鱼(Paralichthys olivaceus)中潜在过敏原。方法采用RPLC-MS/MS技术对牙鲆鱼的蛋白质样品进行蛋白质组学分析。再将牙鲆鱼蛋白质样品在体外模拟胃液中消化,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)电泳观察不同酶解时间下鱼蛋白的酶解情况,将耐酶解的蛋白通过胶内酶解处理后采用RPLC-MS/MS法进行分析。最后将鉴定到的蛋白质与已知过敏原进行序列同源性分析。结果在SDS-PAGE中酶解时间为3 h时位于40 kDa处的条带仍清晰可见,此处的蛋白为耐酶解的蛋白质,经胶内酶解后共鉴定到5种蛋白质。与已知过敏原蛋白进行蛋白序列同源性分析,牙鲆鱼的原肌球蛋白alpha-1与已知过敏原Ore m4的序列相似度较高。2种蛋白质的一致性和相似性分别为96.5%和97.9%。甘油醛-3-磷酸脱氢酶与已知过敏原Tri a 34序列对比一致性和相似性分别为72%和83%。肌酸激酶1与已知过敏原Penm2序列对比的一致性和相似性分别为42%和63%,2组序列相似度大于35%,说明也具有相似性。结论耐胃蛋白酶酶解的大部分蛋白质是潜在的过敏原,其序列与其他物种已知的蛋白过敏原高度相似。该方法可作为筛选食物中潜在过敏原的一种新方法。     

牙鲆GH基因外显子多态性与生长性状关系的初步研究

以一个牙鲆养殖群体中的100个个体为实验材料,根据其生长激素(GH)基因的五个外显子序列设计引物,进行PCR扩增,通过SSCP分析技术对其进行检测,结果表明该群体生长激素基因的第四个外显子存在多态性.共检测到两种基因型,其中AA型个体占88%,AB型个体占12%;DNA测序结果表明,AB型在第1763位发生碱基突变,c→t,与AA型同源性达到99%,同时发现不同基因型的个体在体重和头长上表现出显著的差异(P＜0.05).上述结果表明利用PCR-SSCP技术可以检测到牙鲆生长激素基因外显子部分存在序列遗传多态性,且该多态性与其生长的某些性状具有一定的连锁关系,为将来进行标记辅助选育奠定了基础.     

牙鲆红细胞免疫功能的初步研究

通过尾静脉采血收集养殖牙鲆的外周血细胞,以金黄色葡萄球菌作为吞噬原测定了外周血细胞的免疫吞噬活性.结果表明,牙鲆外周血中至少存在3种形态的白细胞具有明显的吞噬活性,吞噬指数和吞噬百分率分别为1.95±0.25和(21.1±1.4) %.首次观察到牙鲆红细胞具有较强的吞噬能力、变形能力和免疫粘附能力,表明牙鲆红细胞除具有运输O2和CO2的机能外,还具有重要的免疫防御功能.同时发现牙鲆外周血细胞的吞噬活性在不同温度下表现不同,在相对低温条件下(15℃)表现最高,与牙鲆生活的最适水温16～21℃接近,而在35℃时吞噬活性最低,表明温度会影响牙鲆血细胞的吞噬活力.     

微冻和冷藏对牙鲆贮藏品质的影响

以感官、理化和微生物为指标,研究了微冻(-2℃)和冷藏(4℃)对牙鲆品质变化及货架期的影响。结果表明,随着贮藏时间的延长,牙鲆鱼的感官品质显著下降(p0.01),菌落总数、挥发性盐基氮(TVB-N)含量、硫代巴比妥酸(TBA)值和K值均呈显著上升趋势(p0.01),且微冻贮藏时各指标的变化速率都低于冷藏;质构特性中的硬度、弹性、咀嚼度和粘聚性随贮藏时间的延长而显著下降(p0.05),p H与贮藏时间及其他理化指标(TBA除外)相关性不显著。综合感官评分、TVB-N值及菌落总数等指标得出牙鲆在4℃和-2℃贮藏条件下的货架期分别为9 d和12 d。与冷藏相比,微冻能更有效地抑制微生物的生长,延长其货架期。     

牙鲆同质雌核发育人工诱导研究

采用紫外线照射对牙鲆(Paralichthys olivaceus)精子遗传物质进行完全灭活,灭活精子与牙鲆卵子授精获得雌核发育单倍体受精卵,再通过冷休克或静水压法对其进行倍性恢复,成功诱导出同质雌核发育牙鲆.牙鲆精子遗传灭活的最适紫外照射剂量为3.6×10-3J/mm2(照射时间为180s);(15±0.2)℃水温下冷休克法诱导的最适条件为受精后85min,0～2℃水温处理45min;静水压法的最适诱导参数为受精后85min,600kg/cm2压力处理6min,诱导效率静水压法明显高于冷休克法.两种方法诱导组胚胎发育较对照组在原肠期前都有明显滞后现象,开口前同质雌核发育仔鱼比异质雌核发育仔鱼存活率低,但二者全长生长无显著差异(P＜0.05).这些结果为牙鲆纯系建立及其应用提供了重要依据.     

肽聚糖对水产动物特异性免疫力的调节

研究了细菌胞壁A3α肽聚糖(A3α-PG)对水产动物(牙鲆)血清中总免疫球蛋白(总Ig)、免疫球蛋白M(IgM)及白蛋白与球蛋白的比率的影响。在牙鲆饲料中分别添加不同量的A3α-PG:0(对照组)、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0 g/kg,连续投喂40 d,每10 d检测一次上述指标。结果表明:添加A3α-PG后,IgM、总Ig以及白蛋白与球蛋白的比率在40 d时,4.0 g/kg组与对照相组比提高显著(P<0.05);而其它时间段的各项指标受A3α-PG影响的幅度较小,试验组与对照组间差异不显著(P>0.05)。     

牙鲆与大菱鲆病原迟钝爱德华氏菌生物学特性及系统发育学分析

对从7起牙鲆（Bastard halibut,Paralichthys olivaeeus L．）、3起大菱鲆（Turbot,Scophdudmus maximus L．）病害的病（死）鱼中分离到的相应病原菌较系统地进行了形态特征、理化特性等表观分类学指征的鉴定及代表菌株DNA中G＋Cmol％的测定。同时,择代表菌株进行了16SrRNA基因的分子鉴定,测定了16SrRNA基因序列,分析了相关细菌相应序列的同源性,构建了系统发生树。结果表明,分离鉴定的148株菌均为爱德华氏菌属（Edwardsiella Ewing and McWhorter 1965）的迟钝爱德华氏菌（E．tarda）,其中128株为迟钝爱德华氏菌野生型（E．tarda wild type）菌株,20株暂定为迟钝爱德华氏菌吲哚阴性变异株。代表菌株（HC010907—1及HC010830-1）的16SrRNA基因序列,与GenBank数据库中的迟钝爱德华氏菌的同源性均在99％。     

牙鲆红细胞对不同抗原的免疫黏附及Ⅰ型补体受体的检测

采用C3b受体花环实验探究了牙鲆红细胞对不同种类抗原的免疫黏附能力,确定了影响免疫黏附作用的理化因子。实验选取创伤弧菌、金黄色葡萄球菌和啤酒酵母3种不同类别的抗原分别与牙鲆红细胞在优化条件下反应。结果表明,牙鲆红细胞对3种抗原均有免疫黏附作用,在20℃、0.1mol/L PBS~(++)缓冲液的反应条件下,牙鲆红细胞黏附创伤弧菌、金黄色葡萄球菌和啤酒酵母的C3b受体花环率分别为(19.00±1.01)%、(6.09±1.36)%和(3.42±0.00)%,对3种抗原的免疫黏附活性差异显著(P0.05)。利用AKTA快速蛋白液相层析系统的Superdex 200 GL型高效柱分离纯化牙鲆红细胞膜蛋白Ⅰ型补体受体(CR1),通过dot-ELISA法检测发现红细胞膜蛋白组分中含有CR1成分,表明牙鲆红细胞膜上表达了与高等脊椎动物有较高同源性的CR1分子。此实验首次证明了牙鲆红细胞具有发挥免疫功能的重要物质基础。     

一株牙鲆出血症病原菌的分子生物学鉴定

从患出血症养殖牙鲆分离到一株病原菌M4,革兰氏阴性,杆状,有极生和侧生鞭毛 ,能运动,菌落半透明.进行了常规生理生化和BIOLOG-GN细菌鉴定系统测试,结果表明菌株M4与V.carchariae的表型特征非常相似.为了进一步确定M4的分类学地位,测定了其 16S rRNA基因序列,分析了相关细菌相应序列的同源性,构建了系统发生树,结果表明菌株M4与 V.carchariae的亲缘关系最近.综合上述结果,菌株M4可鉴定为Vibiro carchariae .