保健食品铁皮石斛及其混淆品的分子鉴别及亲缘关系分析

目的：寻找简易且重复性高的分子标记方法对保健食品铁皮石斛及其混淆品进行分子鉴别并对其亲缘关系进行分析。方法：对铁皮石斛及其混淆品的matK 基因进行扩增、测序并进行序列分析,寻找其中存在的单核苷酸多态性(SNP)位点并根据SNP 位点设计特异性鉴别引物;运用Mega 3.0 等软件进行遗传关系分析。结果：根据matK 基因序列中存在的SNP 位点及特异性鉴别引物,可将铁皮石斛与其混淆品成功分开;各样品之间存在较大的遗传差异。结论：SNP 位点及特异性鉴别引物可对保健食品铁皮石斛及其混淆品进行快速、简便的鉴别,通过matK 基因可以分析正品与混淆品之间的亲缘关系。     

抗赭曲霉毒素A单克隆抗体的制备及免疫学鉴定

通过碳化二亚胺法(EDC法)制备免疫原OTA-BSA,并免疫小鼠,经杂交瘤技术建立产抗赭曲霉毒素A(OTA)单克隆抗体的杂交瘤细胞株1株。通过体内诱生腹水法制备腹水,纯化后对其亚型、效价、灵敏性、亲和性、特异性等免疫学特性进行鉴定;单抗亚类为IgG1型,间接ELISA效价1:6.4×105,IC50为112.8pg/mL,亲和常数为9.74×1011L/mol,与赭曲霉毒素B交叉反应率为5.6%,与其他常见真菌产物交叉小于0.003%;本实验制备的抗OTA单克隆抗体具有高效、敏感、特异等特点,适合OTA的免疫学快速检测。     

α-半乳糖苷酶辅助饱和硫酸铵法制备IgG及其活性研究

以新鲜牦牛血为原材料,采用α-半乳糖苷酶辅助饱和硫酸铵盐析处理获得免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG),选取酶解时间、酶解pH、酶解温度、酶添加量4个因素,在4个单因素的基础上,利用响应面分析法,得到α-半乳糖苷酶辅助饱和硫酸铵法制备IgG的最佳酶解条件。并采用ELISA方法检测经过酶处理后样品IgG活性含量。结果表明,酶解时间2h、酶解pH 4.4、酶解温度39℃、酶添加量5mL(467.5 U),在该工艺条件下,IgG的含量最高,可达27.13mg/mL,比不加酶处理IgG含量(22.35 mg/mL)提高了21.39%(P0.05)。经过酶处理后样品IgG活性含量为15.92mg/mL,比不加酶处理IgG活性含量(16.07 mg/mL)下降了0.93%。     

分子标记鉴定法鉴别3种麻类韧皮纤维的研究

文中开发了一种利用特异性PCR(聚合酶链式反应)引物组进行分子标记的辅助方法,以实现对汉麻、苎麻和亚麻的韧皮纤维进行分子生物学鉴定。采用收集的汉麻、苎麻、亚麻3种麻类植物的9个亚种提取基因组DNA并进行简化基因组测序,通过建库与筛选得到能用于鉴定3种麻类韧皮纤维种类的3组特异性PCR引物组。结果表明:通过PCR扩增试验验证证明设计的引物组能实现对汉麻、苎麻和亚麻韧皮纤维种类的定性鉴定;使用植物基因组DNA提取试剂盒法可获得高质量的麻类韧皮纤维DNA样品用于后续的分子标记鉴定方法。     

基于ACC变换和RFE算法的蛋白质亚核定位预测

获取真核细胞中细胞核内蛋白质定位的信息对注解蛋白质功能具有非常重要的意义。针对于利用计算方法预测蛋白质在亚核水平上的定位更具挑战性的问题,提出了基于自互协方差变换与递归特征消除预测蛋白质亚核定位的方法。该方法基于位置特异性得分矩阵利用自互协方差变换构建蛋白质序列的特征向量,采用递归特征消除法进行特征选择,选用支持向量机作为预测工具,并在两个经典数据集SC714和LD504上进行了夹克刀测试。实验结果表明,该方法比大多数已报道的预测方法具有更高的预测准确率。     

棉子糖及水苏糖对兔外周血中性粒细胞功能的影响

棉子糖及水苏糖是大豆低聚糖的主要组成成分,属于半乳糖苷类非还原性功能低聚糖。在保健性食品、糖果和医药及饲料添加剂方面有广泛的应用。两种寡糖胃肠吸收虽少,但生物活性很高,具有防癌、抗癌、抗衰老、降血脂及防治心脑血管病等功能目,还能促进外周血T淋巴细胞的增强。正常人每天仅需摄取2～5g的棉子糖或水苏糖就能促进双歧杆菌的增殖,提高机体免疫力。棉子糖及水苏糖具有的整肠作用能促进肠道内有益菌群的活化和增殖,促进对矿物元素的吸收。饲料中添加o．1野叼．3％的水苏糖就能提高动物的抗病能力日。已经证明,水苏糖具有对动物机体的免疫调节作用月,但这两种糖对中性粒细胞这一非特异性免疫系统中重要的效应细胞的影响目前尚未有研究。本文就该方面问题做了初步研究。     

MenA PS-EA偶联物的制备及其在多糖抗体检测中的应用

目的制备MenA PS-EA偶联物及以MenA PS-EA为包被抗原的A群脑膜炎奈瑟菌多糖IgG抗体的ELISA检测试剂。方法培养A群脑膜炎奈瑟菌,提取多糖(MenA PS),与卵清蛋白(EA)以还原氨基法偶联,Sepharose CL-4B纯化。制备以MenA PS-EA为包被抗原的A群脑膜炎奈瑟菌多糖IgG抗体的ELISA检测试剂,考察试剂的精密性和稳定性,并与血清杀菌力试验(SBA)比较。结果纯化的MenA PS-EA经高效液相色谱检测,纯度为81.50%;以MenA PS-EA为包被抗原的ELISA检测试剂精密性和稳定性良好;将该试剂与SBA法比较,其敏感性为96.91%,特异性为90.00%,一致性为95.83%。两种检测方法之间差异无显著意义。结论以纯化MenA PS-EA作为包被抗原建立的A群脑膜炎奈瑟菌多糖特异性IgG抗体ELISA检测试剂可用于检测多糖IgG抗体,为进一步研究及开发细菌多糖类抗体诊断试剂提供参考。     

梅毒螺旋体特异性抗原TpN47基因片段的克隆与表达

目的在大肠埃希菌中表达梅毒螺旋体(Tp)TpN47(68~410 aa)重组蛋白。方法采用PCR法从Tp全基因组中扩增TpN47(202~1230 bp)片段,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-22 b(+)-TpN47,经酶切鉴定后转化EcoliBL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经Ni2+亲和层析柱纯化,Western blot鉴定其免疫反应性。结果PCR法扩增出约1 000 bp的目的片段,原核表达质粒pET-22 b(+)-TpN47经酶切鉴定正确,表达的蛋白约占菌体总蛋白的43%,相对分子质量约为39 000,以包涵体形式存在。经纯化后蛋白纯度达95%以上,Western blot证实该蛋白能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应。结论所表达的TpN47重组蛋白具有良好的免疫反应性,为开发临床检测效果更好的梅毒诊断试剂盒奠定了实验基础。     

促凋亡蛋白BID多克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗BID的多克隆抗体,用于检测凋亡信号转导过程中BID蛋白的表达。方法采用PCR技术合成编码BID特异性肽段的基因,构建GST融合基因表达载体,在E.coli BL21中诱导表达GST-BID多肽的融合蛋白,经Glutathione Sepharose 4B纯化后免疫家兔,免疫血清经纯化后,得到抗BID的多克隆抗体,经Western blot鉴定其特异性。结果通过PCR扩增获得了BID肽段的编码基因;pGEX-6P-1-BID多肽重组质粒经酶切鉴定及测序证明构建正确;在E.coli BL21中表达了GST-BID多肽融合蛋白;纯化后蛋白纯度达95%;制备的抗BID多克隆抗体能够特异地识别BID蛋白。结论所制备的抗BID多克隆抗体可特异性检测BID蛋白。     

巨细胞病毒感染PCR检测方法的建立

目的建立检测巨细胞病毒污染的PCR检测方法,并制备检测试剂盒。方法采用TaqMan探针,选择保守序列CMV-pp65设计引物,荧光定量病毒载量;对试剂盒进行敏感性、重复性和特异性等测试;对31份临床阳性血清标本和106份正常献血者血浆标本进行检测,并与国内同类试剂盒进行比较。结果该试剂盒检测线性定量范围可达202~3.6×109copies/ml,敏感性为360copies/ml,CV值在1%左右,特异性高,临床标本检测的符合率为100%。本试剂盒与国内已上市试剂盒比较,具有较好的相关性、更高的敏感性和更宽的定量检测范围。结论制备的试剂盒特异性和敏感性均较高,适用于临床上的病毒检测。