免疫磁珠分离技术在微生物学检测中的应用

免疫磁珠分离技术(IMBS)是近年来国内外研究较多的一种新的免疫学技术。本文主要介绍了免疫磁珠分离技术的基本原理及其在微生物学检测中的应用概况。     

法医DNA样品自动化预处理平台布局设计及应用

目的:系统介绍自行设计研发的法医DNA样品自动化预处理平台的整体布局,并检测其提取效果,为该平台的使用建立依据。方法:基于磁珠提取法结合现有提取试剂盒的基本提取步骤,对该平台的分离、吸附、洗涤、洗脱等流程进行详细介绍,并针对血斑样本进行实际检测。结果:40个血斑样本在该平台上提取的DNA,其OD260/OD280均大于1.75,扩增产物在GA118-16A遗传分析仪上进行电泳,STR分型准确,位点完整,无等位基因丢失,图谱峰形尖锐清晰,并且信号较强。结论:法医DNA样品自动化预处理平台对整体布局及运动路径进行合理设计,从而加快了DNA提取速度,提高DNA提取纯度,可满足法庭科学DNA提取的应用要求。     

氨基化磁珠非靶向富集食源性致病菌的条件筛选及优化

该研究基于氨基化磁珠静电富集细菌技术,建立了一种可同时富集鼠伤寒沙门氏菌,金黄色葡萄球菌,单增李斯特氏菌的方法。在每2 mL单菌液中（103 CFU/mL）分别加入5~200 μg的3种粒径的氨基化磁珠（1 μm、300 nm、100 nm）,当孵育5~90 min时检测各细菌的富集效率。将单菌液体系的富集正交试验结果应用至混和菌体系的单因素试验和正交试验,将最终结果应用至大体积实验体系以及实际样本（市售牛奶、水果沙拉）。结果表明,当氨基化磁珠添加量为50 μg、孵育时间为30 min时对3种病原菌可以达到60%以上的捕获率,所有反应均在pH值7.4的PBS中进行。磁珠粒径选择300 nm（p<0.05）。在实际样本牛奶、水果沙拉中,当三种混合菌的最低终浓度为2×102 CFU/g（mL）时,捕获率高于55%,结果可达到荧光定量PCR的检测低限。氨基化磁珠与免疫磁珠比较,其具有稳定保存、低成本,高效率等优势,其非靶向富集的能力为下游食源性致病菌的快速检测提供有效前处理富集手段。     

DNA 提取方法对实时荧光定量 PCR 检测花生过敏原 Ara h 2 基因的比较研究

目前,食物过敏是一个世界性的公共卫生问题,其中花生过敏最为严重。基于DNA的分子生物学检测方法目前已广泛应用于花生过敏原检测,样品DNA的提取质量会显著影响检测的灵敏度及准确率。本研究比较了5种DNA提取方法,包括十六烷基三甲基溴化铵（cetyl trimethyl ammonium bromide,CTAB）法、柱式法及3种基于磁珠纯化技术的DNA快速提取法,对生花生、煮花生、炸花生、烤花生、花生酥和花生酱6种不同加工方式的花生基质样品进行DNA提取,考察了不同方法获得的DNA浓度、纯度指标,并采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）对花生过敏原Ara h 2基因进行了检测分析。结果表明,月桂酰肌氨酸钠（Sodium Lauroyl Sarcosine）磁珠法（简称SLS磁珠法）的适用性广、提取率高,对于6种花生基质提取的DNA均能高效检出花生过敏原Ara h 2基因;对于花生含量为0.05%～1.00%的小麦粉二元混合物,SLS磁珠法的DNA提取率总体优于CTAB法,并且能有效提取出与花生共用一条生产线的燕麦片中污染的花生DNA,证实SLS磁珠法提取的实际样品DNA能够满足花生过敏原检测目的。本研究为花生及其制品DNA提取方法提供了参考,特别是磁珠类方法,高效快速,提取质量能够保障后续基于DNA的花生过敏原分子生物学方法检测结果的准确性。     

量子点免疫标记法检测福氏志贺氏菌

研究基于抗原抗体反应捕获目标菌,结合生物素与亲和素间的特异性相互作用,联合免疫纳米磁珠磁性分离、免疫量子点荧光标记技术,运用荧光检测系统,建立了福氏志贺氏菌的定量检测模型。结果表明,福氏志贺氏菌菌浓度为102CFU/mL~105CFU/mL,相对荧光强度与菌浓度关系为FI=12.78lgN+15.941,呈良好的线性关系,决定系数R2=0.9761。进一步对模型的准确度和精确度进行验证,得到菌落浓度预测值与真实值差异小,检测相对标准偏差为1.8%,表明模型的准确度好,精密度高。该方法可简单、快速（2h）、高效地检测福氏志贺氏菌。     

磁珠载体-电化学免疫分析研究进展

磁珠不仅拥有巨大的比表面积和高效的分散能力,而且在其表面可以形成牢固的免疫复合物;同时利用磁珠的超顺磁性可以快速的将其分离,样品前处理简单,不需要预浓缩、净化等复杂工序就可以实现对目标物的快速检测。此外,电化学分析技术具有超高的灵敏度,因此将磁珠与电化学免疫分析技术相结合,利用两者的优点则给人们提供了一种新的检测思路。目前,该领域研究活跃,并取得了重要研究进展,开发出了灵敏度高、检测速度快、简便易用的微型电化学免疫检测系统,可以用于食品检测、环境评估和临床诊断等领域。本文介绍了以磁珠为固相载体的电化学免疫分析技术的最新研究进展,特别是从磁电极免疫分析、基于旋转圆盘电极的免疫分析、酶标记免疫磁珠分析和纳米粒子标记免疫磁珠分析四个方面进行具体论述,并对该领域的发展前景做了展望。     

免疫磁珠分离-实时荧光PCR快速检测虾中沙门氏菌

建立了免疫磁珠分离(Immunomagnetic separation,IMS)联合实时荧光PCR(real time PCR)快速、灵敏地检测虾中沙门氏菌的方法。用纳米磁珠与抗沙门氏菌多克隆抗体制备免疫磁珠,优化反应条件,建立IMS方法。同时针对沙门氏菌ttr基因合成探针和引物,构建real time PCR体系,选4株代表性的沙门氏菌检测其特异性和灵敏度。结果显示,免疫磁珠的最适添加量为100μL,免疫磁珠与样品菌液的最佳反应时间为30 min。建立的免疫磁珠分离-实时荧光PCR(IMS-real time PCR)方法特异性高,对于虾中沙门氏菌的检测限为鼠伤寒沙门氏菌5×10~1 CFU/25 g,猪霍乱沙门氏菌5×10~2 CFU/25 g,肠炎沙门氏菌和甲型副伤寒沙门氏菌1×10~2CFU/25 g,检测全程可在6 h内完成。对40份实际样品,IMS-real time PCR方法与国标法检测结果完全一致。建立的IMS-Real time PCR方法用时短、灵敏度高,为水产品中沙门氏菌的快速检测提供了技术支撑,对沙门氏菌引起的食源性疾病的预防和控制具有现实意义。     

基于磁珠法的肉制品DNA快速提取方法研究

本研究建立了一种基于磁珠法的肉类DNA快速提取技术。该技术以十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）为裂解液,70%乙醇为漂洗液,羟基磁性微球为DNA吸附介质,从裂解液浓度、裂解时间、漂洗次数3方面进行优化。研究发现裂解液为2%CTAB、裂解时间10 min,漂洗次数2次时,基因组DNA提取效果最优。本研究建立的磁珠法肉类DNA提取技术可作为基层实验室自建肉类DNA提取方案,用于肉类DNA的快速提取,为肉类食品安全检测提供技术保障。     

融合蛋白Trx-T4 DL可溶性表达、纯化与其生物活性应用

构建含SUMO、IF2、GST、NusA、MsyB、Trx和MBP融合标签的重组表达载体,转化到大肠杆菌E.coli Transetta (DE3)中进行自诱导(auto-induction,AI)表达,以提高T4 DNA连接酶(T4 DL)的表达产量。通过磁珠法检测融合蛋白的可溶性表达情况,10% SDS-PAGE电泳结果显示,重组菌Transetta (DE3)(pNBEVⅡ-T4 DL)诱导表达的可溶性融合蛋白Trx-T4 DL的产量最多,经诱导培养条件优化后,Trx-T4 DL的可溶性大幅度提高,确定了最佳诱导条件为30℃、装瓶量50 mL/250 mL、接种量2‰、pH7。分别用镍柱和MagNi磁珠纯化重组菌破碎后上清中的融合蛋白Trx-T4 DL,结果显示后者纯化效率更高,最终获得的融合蛋白浓度为1700.462 mg/L。与其他公司T4 DL活性进行比较,检测其酶活性约为500 U/μL,并使其成功应用于低背景重组克隆载体构建中,为融合蛋白Trx-T4 DL的生产及应用提供理论基础。     

副溶血弧菌的磁珠捕获及检测

建立结合免疫磁珠和PCR快速检测副溶血性弧菌的新方法。本研究选用副溶血弧菌作为抗原免疫日本大耳兔制备了多克隆抗体,用ELISA法检测抗体效价。利用辛酸硫酸铵沉淀结合逆向吸附对多抗血清进行纯化,经SDS-PAGE和斑点杂交检测验证纯化后抗体的特异性。将纯化后的抗体偶联于羧基化修饰的纳米磁珠表面,用来进行菌体的捕获。结果表明,抗体的效价达到106,纯化获得只与副溶血弧菌发生反应的高纯度抗体。制备的免疫磁珠捕获率在55%～70%之间,且稳定性较好,盐离子浓度（3.5%NaCl、4.5%NaCl）对捕获率的影响不大,在pH5～9之间,磁珠捕获差异也较小。在对纯培养物的检测实验中,本方法最低检测限为102cfu/mL;而在鱼肉糜样本中的检测限为103cfu/mL,且样品中高浓度杂菌的存在不影响检测灵敏度。免疫磁珠结合PCR用于副溶血性弧菌的检测具有很高的灵敏度和特异性,具有广阔的前景。