重组Flag-pA-Tn5蛋白的原核表达及酶活性鉴定

目的 构建Flag-葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A,SPA)与转座酶Tn5基因的重组原核表达质粒p TXB1-Flag-pA-Tn5,在大肠埃希菌中表达、纯化重组Flag-pA-Tn5蛋白,并检测其转座酶活性。方法 合成Flag-pA基因的DNA编码序列,PCR扩增后插入原核表达载体pTXB1-Tn5,构建重组原核表达质粒pTXB1-Flag-pA-Tn5;转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达带有Flag标签的pA-Tn5蛋白,并经几丁质树脂亲和纯化后透析复性;将Flag-p A-Tn5蛋白与含测序引物接头的转座子DNA片段组装成转座体,取不同稀释比例的转座体与人外周血白细胞基因组DNA共孵育,以DNA孵育产物为模板、测序引物进行PCR扩增,鉴定Flag-pA-Tn5转座酶活性。结果 重组原核表达质粒pTXB1-Flag-pA-Tn5经双酶切和测序证明构建正确;表达的重组蛋白产量为211.1μg/mL,能够被几丁质树脂亲和纯化,纯度为84%;Flag-pA-Tn5蛋白与转座子DNA片段组装后,能有效切割人外周血白细胞基因组DNA,并连接测...     

大豆蛋白水解酶产生菌A2发酵条件及其酶学性质

大豆蛋白水解酶产生菌A2的最适产酶条件:装液量20mL/250mL,转速150r/min,接种量9%,发酵温度35℃,发酵时间16h,酶的最适作用pH和温度分别为7、45℃。在最适条件下酶活力为371.2U/mL。55℃保温150min残余酶活53.8%。pH在7稳定性较好。     

黄杆菌肝素酶Ⅱ的克隆与表达

目的克隆并表达黄杆菌肝素酶Ⅱ(HepⅡ)的基因。方法通过PCR从黄杆菌基因组DNA中扩增出黄杆菌HepⅡ的基因,经验证后插入到表达质粒pET-28a上构建表达载体,重组质粒转化E.coli BL21(DE3)进行蛋白质表达。结果成功地将PCR扩增得到的测序正确的HepⅡ基因构建入pET-28a载体上,重组质粒转入E.coli BL21(DE3)后表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定得到目的蛋白,测活显示重组HepⅡ具有活性。结论克隆并成功表达了黄杆菌HepⅡ基因。     

不同品种烤烟成熟期糖代谢酶活性及基因的表达分析

为了探究不同品种烤烟成熟期糖代谢的变化规律,明确烟叶品质形成的分子作用机理。以烤烟品种秦烟96、豫烟6号和K326为试验材料,测定分析了烤烟成熟期水溶性糖组分（葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、还原糖和可溶性总糖）含量、糖代谢关键酶活性及基因表达的变化。结果表明,3个品种烤烟水溶性糖组份含量变化趋势基本一致,各水溶性糖（蔗糖除外）含量呈先升高后降低的变化趋势,烟叶成熟时其含量达到峰值;蔗糖含量呈双峰波动,烟叶成熟时蔗糖含量较低。烟叶打顶至适熟阶段,SPS和AI酶活性对烟叶中水溶性糖的积累贡献最大,NtINV对烟叶糖代谢起主要调控作用;当烟叶由适熟至过熟时,AI酶活性主要参与烟叶糖代谢活动,而SS和SPS则对蔗糖积累起重要作用,NtSS和NtSPS对烟叶糖代谢起主要调控作用。同一生态环境和栽培条件下,豫烟6号内含物质充实,具有较高的水溶性糖分含量,SPS和AI酶活性的差异可能是造成烟叶糖组分及含量不同的重要原因。     

转基因SOD高表达烟草杂交F1代的SOD和POD研究初报

以转基因Fe-SOD、Mn-SOD高表达烟草和非转基因烟草品系为亲本进行正、反交,得到6个组合的F1代。对杂交后代7叶龄烟苗的研究表明,Mn-SOD高表达烟草×非转基因烟草后代的SOD、POD活性均明显高于其它杂交后代,其中SOD活性高出36.00%～66.42%,POD活性高出8.01%～85.27%。6个杂交组合均有3条SOD同工酶带,类型为Cu,Zn-SOD(迁移率为0.02)、Fe-SOD(迁移率为0.042)和Mn-SOD(迁移率为0.319),具有7条POD同工酶带。杂交组合间SOD和POD同工酶不存在明显差异。     

高铁肌红蛋白含量和高铁肌红蛋白还原酶活性与冷鲜肉肉色稳定性关系的研究

以皖白Ⅲ背最长肌和腰大肌为研究对象,研究了冷藏1～9d肉样肉色稳定性与高铁肌红蛋白含量和其还原酶活性的关系.结果表明,腰大肌亮度(L*值,P＜0.01)极显著低于背最长肌,而红度(a*值,P＜0.05)显著高于背最长肌;a*值随储藏期延长呈下降趋势,L*值和b*值呈整体上升趋势;三者表明储存期越长,肉色将越暗.a*值与高铁肌红蛋白含量呈弱负相关性;而与还原酶活性呈中等程度正相关,其中3、5、7d二者正相关达到显著性水甲(p＜0.05).根据研究结果建议冷鲜肉储藏期不宜超过5d.     

螺旋藻β-胡萝卜素代谢通量调控规律的研究

结合细胞组成数据建立了螺旋藻β-胡萝卜素的代谢通量分析模型,对不同温度下培养的螺旋藻β-胡萝卜素的代谢通量进行了分析.结果显示,温度对β-胡萝卜素的代谢通量影响较为明显,33℃下通量最高,为6.51.测定了不同培养温度下β-胡萝卜素合成途径中11种相关酶的活性,并利用相关分析和主成分分析研究了酶活性对β-胡萝卜素通量的调控规律,建立了基于相关分析和主成分分析的类似与代谢控制系数的分析参数Cci,很好地反映了酶对通量的控制程度.结果显示,RuBP羧化酶(CcRuBisCO=0.296),葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(CcG6PD=0.23)和丙酬酸脱氢酶(CcPDHC=0.221)对β-胡萝卜素通量具有相对较高的控制作用,说明它们对通量起着主要控制作用;α-酮戊二酸脱氢酶(Ccα-KODHC=-0.102)、磷酸甘油酸变位酶(CcPGM=-0.081)和异柠檬酸脱氢酶(CcICDH=-0.074)的系数为负值,说明它们对通量具有一定程度的负控制作用.     

不同菌种发酵对纳豆激酶活性及黏液成分影响

采用5株不同来源的纳豆菌JLTH-075、JLGZL-018、JLTH-157、JLCC-243、JLLY-214,通过纳豆发酵实验,研究不同菌株对纳豆激酶活力、黏液营养物质的影响,评价其发酵性能,为纳豆工业生产用菌筛选提供借鉴。结果表明,菌株JLGZL-018生产的纳豆激酶活性最高,为4 167 IU/g;其生产的纳豆黏液成分中总蛋白、可溶性总糖含量最高,分别为（17.38±0.54）%、（5.21±0.13）%;水解氨基酸总量适中,为（5.24±0.27） g/100 g,7种必需氨基酸含量最高,为（0.87±0.08） g/100 g;游离氨基酸各成分与其他4株菌无显著差别。菌株JLGZL-018综合发酵性能较好,具有开发应用潜力。     

不同微量金属离子对绿色木霉产纤维素酶的影响

在绿色木霉产纤维素酶过程中,以单因素实验为基础研究不同金属离子对纤维素酶活性的影响,利用Design-Expert 7.1.6软件响应面分析法优化在纤维素酶活性最大时的最佳金属离子浓度的添加量.结果表明,当培养基中分别加入的Mn2+、Cu2+、Cr2+及Mo2+四种金属离子含量从0.2mg/L按照一定的梯度提高到5mg/L时,纤维素酶的活性变化不大,而Fe2+浓度、Se2+浓度、Zn2+浓度、Fe2+浓度与Se2+浓度两因素的交互作用对纤维素酶活影响显著.培养基中Fe2+浓度为19.5mg/L,Se2+浓度为2.1 mg/L,Zn2+浓度为14mg/L时,纤维素酶活性达到7.9(μg/ml)且为最大值.     

海洋假单胞杆菌褐藻胶裂解酶基因在大肠杆菌中的高效表达和活性检测

利用PCR方法从假单胞杆菌基因组DNA扩增胞外褐藻胶裂解酶的全基因和缺损片段,构建表达质粒pQE30-aly32和pQE30-aly165,并在大肠杆菌M15中成功表达。表达的重组蛋白大部分存在于包涵体中,经洗涤,变性和复性,镍柱亲和层析纯化,获得了电泳纯的Aly32和Aly165。酶活性检测发现,仅Aly165具有较强活性,108 u/mg,该酶对poly(G)和poly(M)都有活性,对poly(M)更敏感。对表达体系进行优化,确定IPTG的最佳浓度为0.6mmol/L,最佳诱导菌液密度OD600为0.5~0.6,最佳表达时间为3h,28℃低温诱导可以提高重组蛋白的可溶性,可溶性蛋白相对表达量达到25%。