水产品中创伤弧菌ddPCR定量方法的建立

选取创伤弧菌单拷贝基因met为靶基因,设计引物探针,建立对创伤弧菌准确定量的微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)方法,并进行特异性、灵敏度和重复性实验,同时与实时PCR(real-time PCR)方法进行比较。结果显示,所建立的ddPCR方法可以快速、高效地检测出创伤弧菌,细菌纯培养物中其定量限可达323拷贝数/mL,检测限可达61拷贝数/mL,人工污染牡蛎样品中能最低能检测到1.13×102拷贝数/g的目标菌。对人工污染样品中目标菌的检测,ddPCR的定量结果约为平板计数结果的1.4倍,比real-time PCR方法的检测更加稳定准确。本研究建立的ddPCR检测方法能快速准确、特异、灵敏地定量检测创伤弧菌。     

Inactivation of Vibrio parahaemolyticus in Hard Clams (Mercanaria mercanaria) by High Hydrostatic Pressure (HHP) and the Effect of HHP on the Physical Characteristics of Hard Clam Meat

Shellfish may internalize dangerous pathogens during filter feeding. Traditional methods of depuration have been found ineffective against certain pathogens. The objective was to explore high hydrostatic pressure (HHP) as an alternative to the traditional depuration process. The effect of HHP on the survival of Vibrio parahaemolyticus in live clams (Mercanaria mercanaria) and the impact of HHP on physical characteristics of clam meat were investigated. Clams were inoculated with up to 7 log CFU/g of a cocktail of V. parahaemolyticus strains via filter feeding. Clams were processed at pressures ranging from 250 to 552 MPa for hold times ranging between 2 and 6 min. Processing conditions of 450 MPa for 4 min and 350 MPa for 6 min reduced the initial concentration of V. parahaemolyticus to a nondetectable level (<10¹ CFU/g), achieving >5 log reductions. The volume of clam meat (processed in shell) increased with negligible change in mass after exposure to pressure at 552 MPa for 3 min, while the drip loss was reduced. Clams processed at 552 MPa were softer compared to those processed at 276 MPa. However, all HHP processed clams were found to be harder compared to unprocessed. The lightness (L*) of the meat increased although the redness (a*) decreased with increasing pressure. Although high pressure‐processed clams may pose a significantly lower risk from V. parahaemolyticus, the effect of the accompanied physical changes on the consumer's decision to purchase HHP clams remains to be determined. Practical Application : Shellfish may contain dangerous foodborne pathogens. Traditional methods of removing those pathogen have been found ineffective against certain pathogens. The objective of this research was to determine the effect of high hydrostatic pressure on V. parahaemolyticus in clams. Processing conditions of 450 MPa for 4 min and 350 MPa for 6 min reduced the initial concentration of V. parahaemolyticus to a nondetectable level, achieving >5 log reductions.     

活的非可培养状态副溶血性弧菌实时荧光逆转录PCR检测方法的建立及其毒力研究

目的 建立检测活的非可培养(VBNC)状态副溶血性弧菌的荧光逆转录PCR方法并研究其毒力基因表达.方法 将副溶血性弧菌AS079菌株添加到陈化海水中,4℃冰箱内培养,使其进入VBNC状态,针对其管家基因、鉴定基因和毒力基因分别设计实时荧光逆转录PCR引物,通过不同的PCR反应程序和引物浓度组合试验,摸索最佳反应体系条件,用于VBNC状态副溶血性弧菌的检测和毒力研究.结果 用所建立的检测VBNC状态副溶血性弧菌的实时荧光逆转录PCR方法,对接种于陈化海水培养的不同时期的AS079副溶血性弧菌进行荧光定量逆转录PCR扩增,结果显示,随着培养时间的延长,毒力基因tdh2和鉴定基因toxR表达水平持续下降,但即使细菌进入VBNC状态,这两个基因也能够得到很好的扩增,说明以toxR基因和tdh2基因对进入VBNC状态的副溶血性弧菌进行检测和毒力研究方法可行.灵敏度试验表明,鉴定基因toxR的最低检测限可达到48 cfu/ml,研究毒力基因tdh2的表达需要细菌浓度至少为4.8×102cfu/ml,同时试验证明此方法与其他相近食源性致病菌无交叉反应.结论 该实时荧光逆转录PCR方法检测快速、特异性强、敏感度高,适用于VBNC状态副溶血性弧菌的检测和毒力分析.     

不同波长UV对副溶血性弧菌光修复反应的影响

低压水银管是常见的灭菌工具,其一般采用的是波长为254 nm的UVC作为灭菌光源。而UVA（365 nm波长）配合发光二极管（light-emitting diodes,LED）也有明显的杀菌效果。本研究从灭菌能力,照射后细菌的光修复能力和再生长能力以及能耗等方面入手,比较短波长的UVC和长波长的UVA/LED对副溶血性弧菌的灭菌效果。结果显示,UVA/LED比UVC有更强的杀菌能力,且在受到UVA/LED照射后,副溶血性弧菌的再生长明显慢于单纯UVC处理后的细菌;对副溶血性弧菌的光修复酶基因表达水平进行检测发现,UVA/LED照射后副溶血性弧菌三种光修复酶基因的表达水平都无激活现象,而UVC处理后的细菌三种基因表达水平明显升高。我们认为UVA/LED可能抑制副溶血性弧菌的光修复现象。但在具备以上优势的同时,UVA/LED的能耗大大高于UVC,因此该技术还有待进一步改进。     

恒温实时荧光法检测副溶血性弧菌

为了更加准确、快速地检测进出口食品中的副溶血性弧菌,针对副溶血性弧菌的tlh基因设计环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)引物,结合ESEQuant tube scanner来对扩增结果进行实时检测。结果显示:该引物扩增效率高、特异性强、灵敏度高(1-10 CFU/反应,约为荧光PCR的100倍)。126株副溶血性弧菌,恒温荧光法检测出126株,荧光PCR的方法检测出121株。恒温实时荧光检测仪与荧光PCR仪类似,均可以对检测结果进行实时监测和熔解曲线分析,表明该恒温实时荧光检测仪可广泛应用于基础实验室的科学研究或经济发展相对落后区域的临床初步诊断。     

沙门氏菌及副溶血性弧菌的共增菌培养基的研制

为研制一种可同时富集沙门氏菌和副溶血性弧菌的增菌培养基,参照GB 4789.4-2016及GB 4789.7-2013规定的增菌培养基成分,并根据目标菌不同的营养需求,筛选适宜抑制剂和促进剂,进行单因素实验,确定共增菌培养基的配方,并验证该培养基的增菌效果。结果表明:研制出用于沙门氏菌和副溶血性弧菌的共增菌培养基成分为:蛋白胨10.0 g,磷酸二氢钾1.5 g,氯化钠7.5 g,硫代硫酸钠5.0 g,牛胆盐0.1 g,柠檬酸钠2.5 g,甘露醇2.5 g,葡萄糖2.5 g,蒸馏水1000 mL。目标菌初始接种量为10² CFU/mL,在37 ℃下培养16 h后,两种目标菌的菌浓度可达到10⁷~10⁸ CFU/mL。结果表明,共增菌培养基可用于沙门氏菌和副溶血性弧菌的富集培养,培养基配制简易,节约成本,具有良好的市场前景。     

副溶血性弧菌拮抗菌的筛选鉴定及抑菌物质特性研究

为获取既可抑制食源性致病菌又可抑制水产致病菌的益生菌株,以人畜共患致病菌副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus ATCC17802)为指示菌,采用点种法初筛以及打孔扩散法复筛,得到1株来源于上海东海海水的H19菌株,其抑菌物抑菌圈直径达(17.16±0.28)mm。通过形态观察及16SrDNA序列分析可知,菌株H19为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis H19,GenBank登录号:MG383451)。将菌株H19进行抑菌谱试验,探究菌株H19抑菌物的理化性质,并且抑菌物通过硫酸铵沉淀及不同孔径透析袋截留粗提,粗提物经蛋白酶处理及Tricine-SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳可知,该抑菌物具有广谱抑菌活性,既可抑制革兰氏阳性菌又可抑制大部分革兰氏阴性菌,且具有较好的热、pH以及紫外线稳定性,该抑菌物可能为2种新型抗菌肽,分子量分别在6.5~9.5kDa以及27.0~35.0kDa。由此可见,枯草芽孢杆菌H19所产抗菌肽具有防治食源性疾病以及水产疾病的应用潜力。     

4种防腐剂对副溶血弧菌生物膜形成的抑制作用

在确定4种防腐剂壳聚糖、山梨酸钾、脱氢乙酸钠和ε-聚赖氨酸对副溶血弧菌(Vibro parahaemolyticus)的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)的基础上,研究其对副溶血弧菌生物膜的抑制作用。采用结晶紫染色法测生物膜形成量,XTT法测生物膜代谢活性,硫酸-苯酚法测定生物膜中胞外多糖的分泌量。结果表明,壳聚糖的MIC最小,为1.25 mg/m L。4种防腐剂在MIC以及亚抑菌浓度条件下对副溶血弧菌生物膜均有明显的抑制作用,不仅抑制生物膜的形成,而且能显著降低细菌的代谢活性,减少胞外多糖的分泌,其中壳聚糖对副溶血弧菌生物膜的抑制作用最强。     

基于时间分辨纳米荧光微球的免疫层析技术快速检测副溶血性弧菌

由副溶血性弧菌引起的食品中毒事件频繁爆出,开发一种简单、快速且能大规模现场检测的方法对确保食品安全、避免经济损失具有重要意义。该研究成功开发了针对副溶血性弧菌现场快速检测的时间分辨荧光免疫层析技术（TRF-LFIA）。该方法将时间分辨纳米荧光微球（EuNPs）标记副溶血性弧菌单克隆抗体形成可以作为特异性免疫荧光探针的微球抗体偶联物,通过测定探针与目标致病菌结合后的荧光信号值来实现对目标致病菌的定量检测。该研究开发的TRF-LFIA方法对副溶血性弧菌检测的灵敏度为8.2×102 CFU/mL,视觉检测限为1.2×104 CFU/mL,线性范围为1.8×103~1.8×107 CFU/mL,回收率为84.25%~105.13%,变异系数（CV）为2.56%~9.14%,并且对其他7种主要食源性致病菌株检测未发生交叉反应。该研究所建立的TRF-LFIA检测方法具有灵敏度高,操作简单、快速,重复性、特异性好等优点,为针对副溶血性弧菌的现场快速检测提供了一种有力的检测工具。