集成干扰素突变体的构建、表达及纯化

目的构建高效且可供单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺(mPEG-MAL)定点修饰的集成干扰素突变体(IIFNm108),并进行表达、纯化及鉴定。方法采用同源序列对比、空间结构模拟并结合α干扰素与受体结合的特点设计突变位点。用重叠延伸PCR法,扩增IIFNm108基因,与pET-23b载体连接,构建重组表达质粒pET-23b-IIFNm108,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,所得包涵体经变性、复性、DEAE阴离子交换及凝胶过滤两步层析纯化后,进行各项鉴定。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确。目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的30%以上,主要以包涵体形式存在。纯化的IIFNm108蛋白纯度大于95%,比活性约为(2.08±0.17)×108IU/mg,N-端、C-端氨基酸序列与理论一致,相对分子质量为19500,可与mPEG-MAL成功交联。结论已获得一种高效且可供mPEG-MAL定点修饰的集成干扰素突变体IIFNm108。     

湿法磷酸净化除铁的现状

以净化湿法磷酸代替热法磷酸生产磷酸盐已成为近代发展趋势。为了扩大湿法磷酸的应用领域必须净化湿法磷酸中的杂质。从湿法磷酸中分离铁,已经开发了沉淀法、离子交换法、吸附法、溶剂萃取法、膜分离法等方法,各有利弊。     

加氢工艺技术生产25#变压器油

以江苏常二线油为原料,通过加氢微型试验装置,筛选出加氢精制催化剂3996、FV-1,将上述2种催化剂按照1：1（体积比）进行组合装填,进行一段加氢法生产25^#变压器油试验取得成功,并经过了工业生产试运行。结果表明,在适宜的操作条件下,可以利用原白油加氢装置生产出合格的25^#变压器油产品,优化了装置产品结构,提高了装置创效能力。     

重组肺癌抑癌基因1蛋白的表达、纯化及其多克隆抗体的制备

目的表达、纯化重组人肺癌抑癌基因1(Tumorsuppressor in lung cancer1,TSLC1)蛋白,并制备其多克隆抗体。方法采用RT-PCR法扩增TSLC1基因全长编码区序列,克隆入原核表达质粒pQE30,转化大肠杆菌M15,IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经Ni2+-NTA亲和层析纯化后,免疫家兔,ProteinA亲和层析纯化抗血清,并经Westernblot分析其反应原性。结果重组表达质粒pQE30-TSLC1经双酶切及测序鉴定证明构建正确。重组TSLC1蛋白的表达量约占菌体总蛋白的14%,主要以包涵体形式存在。纯化的重组蛋白纯度为93.4%,可与小鼠抗His-Tag单克隆抗体发生特异性反应。以其制备的多克隆抗体具有良好的抗原识别特异性。结论已成功制备TSLC1多克隆抗体,为深入研究TSLC1分子的生物学活性奠定了基础。     

重组人uPA_(17)-KPI大规模发酵及纯化工艺的建立

目的建立重组人uPA17-KPI(rhuPA17-KPI)毕赤酵母工程菌在80L发酵罐中的大规模发酵及纯化工艺。方法对工程菌表达rhuPA17-KPI的pH值进行优化。在摇瓶中制备rhuPA17-KPI工程菌种子2L,接种至80L发酵罐中,采用优化的pH值,补料分批培养方式对工程菌进行高密度发酵,控制和优化各种发酵条件,经甲醇诱导48h后结束发酵。将发酵液离心,经SP Sepharose XL阳离子交换层析和SourceTM 30 RPC反相疏水柱层析纯化。结果建立的发酵工艺为:控制发酵温度为28℃,pH值为5.5,溶氧值为25%～30%之间,在酵母细胞湿重达到190g/L时开始甲醇诱导表达,诱导30h,rhuPA17-KPI的分泌达高峰,为300mg/L发酵液。发酵上清经阳离子交换层析和反相疏水层析纯化后,获得纯度为95%以上的rhuPA17-KPI,产量为180mg/L,回收率为60%。结论已建立了rhuPA17-KPI毕赤酵母工程菌在80L发酵罐中的大规模发酵及纯化工艺,为其产业化及临床应用奠定了基础。     

单环刺螠纤溶酶UFE-Ⅱ的分离纯化及其酶学性质

目的分离纯化单一组分的单环刺螠纤溶酶UFE-Ⅱ,并分析其酶学性质。方法单环刺螠体腔液经离心、超滤、离子交换层析、凝胶过滤等方法进行分离纯化,得到单一洗脱峰酶组分,经Native-PAGE、SDS-PAGE和飞行质谱分析,测定其纯度和相对分子质量;并以酪蛋白为底物,Folin-酚试剂法测定酶活力,对其酶学性质进行分析。结果分离纯化的UFE-Ⅱ具有水解纤维蛋白的活性,其水解酪蛋白的比活力达到375.6U/mg,纯化倍数为10.3倍,回收率为14.0%。UFE-Ⅱ为单一组分,纯度达99%以上,相对分子质量为24329。UFE-Ⅱ的最适反应温度约为45℃;最适反应pH值为7.0;Ca2+、Mn2+和Fe2+是该酶的强激活剂;Fe3+、Cu2+和Pb2+对该酶活力具有一定的抑制作用;SBTI和PMSF能完全抑制酶活力,表明该酶为丝氨酸蛋白酶;糜蛋白酶抑制剂可部分抑制酶活力,亮抑酶肽、抑蛋白酶肽、苯甲脒可较弱地抑制酶活力。结论从单环刺螠体内成功分离纯化出纤溶酶UFE-Ⅱ,并分析了其酶学性质,该酶具有进一步开发利用价值。     

B型肉毒神经毒素的纯化及胰蛋白酶对其作用分析

目的纯化B型肉毒神经毒素,并比较未激活和用胰蛋白酶激活的B型肉毒神经毒素的分子特性,分析在酸性和碱性条件下B型肉毒毒素复合物的完整性。方法取未激活、胰蛋白酶激活和热处理激活的B型肉毒毒素复合物,采用阴离子交换柱层析纯化神经毒素(分别为A、B和C组)。在酸性条件下溶解激活的B型肉毒毒素复合物(D组)。对各组进行纯度(特异毒性)测定和SDS-PAGE分析。结果柱层析后,神经毒素纯度均比复合物的纯度高,激活的神经毒素比未激活的高2～3倍;在非还原和还原条件下,A组的SDS-PAGE显示神经毒素、重链和轻链3条带;B组显示重链和轻链2条带;C组在非还原条件下显示重链和轻链2条带,在还原条件下只显示轻链1条带。在酸性条件下,B型肉毒毒素复合物由神经毒素与非毒性成分构成,在碱性条件下,神经毒素与非毒性成分分离。结论已成功纯化了B型肉毒神经毒素,经胰蛋白酶处理后,单链裂解为双链,比活性提高。     

A Simple,Convenient, and Efficient Preparative GC System that Uses a Short Megabore Capillary Column as a Trap

A simple, convenient, and highly efficient preparative GC system has been developed that uses short sections of megabore capillary columns as sample collection (sorbent) traps. The performance of this system with various types of capillary column traps and under various collection conditions was systematically investigated with model compounds, including C4 to C20 normal alkanes, esters, and alcohols. The thickness and polarity of the sorptive stationary phase and the temperature of the collection trap affected trap performance. Each group of compounds was efficiently trapped above a critical Kovat’s index, and the type of trap (deactivated, methyl polysiloxane, polyethylene glycol), film thickness, and whether or not the trap was cooled significantly shifted this threshold index. Above this critical index, recovery efficiencies of traps with methyl polysiloxane films were 80–100% for a wide range of injected sample mass. For example, a DB-1 collection trap with a film thickness of 1.5 μm methyl polysiloxane operated at ambient temperature trapped >84% of the mass of injected compounds of all three chemical classes with Kovat’s index >1,100 (determined on a nonpolar column) with injected sample mass ranging from 10 to 1,000 ng of each compound. This preparative GC system is technically and economically feasible for most researchers. Furthermore, it is suitable for the preparation of NMR samples of volatile and semivolatile compounds, especially with sample sizes ranging from several nanograms to several micrograms.     

杨树菇中一种脱氧核糖核酸酶的纯化及其性质

目的分离纯化杨树菇子实体中脱氧核糖核酸酶,并对其性质进行分析。方法通过80%饱和(NH4)2SO4沉淀、Blue Sepharose 6 Fast Flow、DEAE-Sepharose Fast Flow和SP-Sepharose Fast Flow层析方法,从杨树菇子实体中分离纯化一种脱氧核糖核酸酶。SDS-PAGE和活性SDS-PAGE测定相对分子质量,采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法分析其酶学性质,并检测pH、温度、Mg2+和EDTA浓度对酶活性的影响。结果经纯化得到了一种脱氧核糖核酸酶,其相对分子质量为31000。该酶对超螺旋质粒DNA、λDNA、ssDNA和dsDNA均具有降解活性,对dsDNA的降解活性略高于ssDNA,且酶活性依赖于二价金属阳离子。该酶的最适pH值范围为7.5～9.6,50℃时相对酶活性最高。结论从杨树菇子实体中纯化的脱氧核糖核酸酶属于一种非限制性脱氧核糖核酸内切酶。     

气体膜分离的原理及其应用于酸性气体净化的研究进展

介绍了膜分离气体的原理以及对膜的选择原则,讨论和展望了该技术在酸性气体净化方面的应用前景,并根据膜分离法的特点,介绍了膜分离法与胺法技术集成,进行含酸性气体的深度净化的方法。