不同粒径的免疫磁珠对食源性致病菌捕获效率的影响

粒径是影响免疫磁珠捕获效率的关键因素。选取微米级（1 μm）和亚微米级（300 nm）超顺磁珠,偶联沙门氏菌多克隆抗体制备免疫磁珠。通过流式细胞仪、分光光度计分别测定抗体偶联量和磁回收率。结果表明,与微米级免疫磁珠相比,亚微米级免疫磁珠抗体偶联量较高,在缓冲液中磁回收率较高,因此捕获率较高（300 nm: 55%,1 μm: 41%）;在牛奶中磁回收率较低,导致捕获率明显降低（300 nm: 15%,1 μm: 26%）。因此,需根据待测样本的体积与黏度来确定免疫磁珠的粒径。     

基于脲酶-金纳米棒的双重放大免疫比色法快速检测食品中黄曲霉毒素B1

该研究提出了一种免疫比色方法用于快速检测黄曲霉毒素B1 。在最优条件下,以免疫磁珠为载体,脲酶-金纳米棒为探针,探针与抗体特异性结合的同时与尿素反应催化沉积外加铜离子产生的显色反应为定量基础,紫外吸收强度作为参考指标,测定样品中的黄曲霉毒素B1 。结果表明,标准曲线的线性回归方程为Y=4.017+1.430 6X,相关系数为0.997,检测限为0.042 ng/mL,加标回收率在92.5%～120.8%之间,表明该方法精密度良好、检测结果可靠。故该免疫比色法可用于检测食品中黄曲霉毒素B1。     

基于免疫纳米磁珠对福氏志贺氏菌的快速富集研究

利用纳米磁珠的超顺磁性,结合传统平板计数的方法,通过捕获效率,研究免疫纳米磁珠制备过程中抗体加入量以及免疫纳米磁珠捕获目标细菌时的加入量,并利用免疫纳米磁珠对纯菌液以及羊肉洗水中100、101、102、103 CFU/mL的福氏志贺氏菌进行捕获.结果表明,志贺氏菌多克隆抗体(4～5mg/mL)结合1mL链酶亲和素纳米磁珠((180±20) nm,2mg/mL)的最佳量为70μL,免疫纳米磁珠捕获高浓度目标细菌(102 ～ 104 CFU/mL)时的最佳加入量为60μL.对于纯菌液和羊肉洗水,其捕获限可分别达到100CFU/mL和101CFU/mL,并且捕获时间在1h之内.本研究优化了实验条件,为免疫磁珠快速富集目标菌提供了理论依据.     

一种新型检测大肠杆菌O157∶H7的免疫磁珠-量子点纳米颗粒的制备和应用

研究建立了免疫磁珠和荧光量子点标记的抗体检测大肠杆菌O157∶H7的方法。采用溶剂热法制备了Fe₃O₄纳米颗粒,并用SiO₂、羧基和大肠杆菌O157∶H7抗体依次包覆制得免疫磁珠。游离的大肠杆菌O157∶H7首先与免疫磁珠结合,然后由量子点标记的抗体与大肠杆菌结合,形成一个三明治结构;随后分析磁分离采集的磁珠的荧光强度（激发/发射波长为370 nm/472 nm）。SiO₂壳结构的引入,减少了传统免疫磁珠的非特异性吸附,提高了对目标菌的选择性,同时有效的阻止了三明治结构中量子点因电子转移至Fe₃O₄而引起的荧光猝灭,保证了分析方法的可行性。动态范围为10～10⁸ CFU/mL,检出限为10 CFU/mL。牛肉、牛奶和蜂蜜样品中大肠杆菌O157∶H7的平均加样回收率分别为95%～104%、90%～94%和90%～110%;相对标准偏差分别为2.1%～3.8%、3.2%～7.8%和5.8%～6.3%。     

利用琼脂磁珠作为载体建立快速HIN-P24核酸适配体的筛选方法

目的：利用磁珠作为载体,建立快速HIV-P24核酸适配体的SELEX筛选方法。方法：利用SELEX技术、磁珠分离及实时定量PCR技术,从随机寡核苷酸库中快速筛选出能与HIV-P24特异结合的寡核苷酸,利用凝胶阻滞实验鉴定所筛选到的HIV-P24核酸适配体复合物,通过连接Pmd18-Tvector,转化E.ColiDH5a感受态细胞得到了阳性克隆。结果：经过4轮筛选并运用凝胶阻滞实验验证了HIV-P24核酸适配体复合物条带明显被阻滞,利用交错PCR鉴定了所挑取的阳性克隆,也得到了测序序列。结论：利用SELEX技术、磁珠核酸分离技术和实时定量PCR技术成功筛选到了2条能与HIV-P24特异性结合的核酸适配体,这几种方法相结合操作简单、能有效提高筛选效率,并且便于机械化操作,为今后的适配体筛选打下良好基础。     

单增李斯特菌免疫磁珠的制备研究

目的:制备可高效、特异地分离单增李斯特菌的免疫磁珠。探讨羧基修饰磁珠与多克隆抗体的不同偶联条件和免疫磁珠捕获单增李斯特菌的能力。方法:以单增李斯特菌作为抗原,免疫新西兰兔,获得兔源多克隆抗体,鉴定其与单增李斯特菌体的结合能力;选择6种不同的偶联缓冲溶液,设置了6个主要偶联时间和6组偶联温度,通过比较磁珠与抗体偶联后上清中剩余的抗体量来确定最佳偶联条件。结果:制备的多克隆抗体效价为1.3×105,该抗体与单增李斯特菌体有较好的结合,抗体与1mg羧基修饰磁珠在pH6.0的0.01mol/L一水吗啉乙磺酸缓冲溶液(MES)中,37℃偶联2h,偶联抗体的量为160μg;制得的免疫磁珠的捕获率可达77.0%。结论:获得羧基磁珠与抗体偶联的最佳条件,该免疫磁珠用于食品中单增李斯特菌的检测,与常规的平皿增菌培养显色法比较,检测时间至少缩短20h。     

羧基化磁性纳米微球的表面生物修饰方法

采用A和B两种羧基化磁珠,以山羊抗小鼠IgG为模式蛋白,优化了EDC/sulfo-NHS法的羧基磁珠表面抗体的修饰条件,对比分析了抗体修饰前后磁珠粒径和多分散系数(PDI)的变化,并利用竞争性免疫层析法评价了磁珠表面修饰抗体的生物学活性。优化结果显示,不同粒径和厂家的羧基磁珠,其表面的最佳抗体修饰条件是不同的。磁珠A抗体修饰前后的平均水力学粒径变化率为6.55%,PDI分别为0.011和0.046,变化微小,而磁珠B在抗体修饰前后的平均水力学粒径变化率为135.55%,分散性能变差。生物学活性评价结果显示优化条件下制备的磁珠A和B表面的抗体均具有较好的抗原结合活性,磁珠B的磁信号强于磁珠A。综上所述,抗体修饰磁珠用于免疫层析检测时,抗体修饰前后磁珠粒径和分散性能的变化、材料的磁响应性能对于检测灵敏度和层析速度具有重要意义。     

免疫磁珠-PCR试纸条快速检测食品中牛源成分方法的建立

建立食品中牛成分快速检测的免疫磁珠-PCR试纸条方法。免疫磁珠提取食品中核酸,设计牛特异性引物,建立牛成分快速检测的PCR-试纸条方法。验证方法的特异性、灵敏度和稳定性。该方法检测灵敏度0.01%,能够从食品中扩增出561 bp特异性DNA片段。建立的食品中牛成分检测的免疫磁珠-PCR试纸条法特异性好,灵敏度高,简便,快速,是食品中牛成分检测的有效方法。     

免疫富集联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法测定牛奶、鸡蛋中的沙门氏菌

目的建立免疫富集联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)检测牛奶、鸡蛋中沙门氏菌的方法。方法沙门氏菌经免疫磁珠特异性富集后采用MALDI-TOF MS鉴定,并优化富集过程中的抗体、免疫磁珠添加量以及捕获时间,研究其特异性,并用于实际样品中沙门氏菌的检测。结果富集过程最佳反应条件为:每1 mg磁珠中抗体添加量为250μg,1 mL菌样中免疫磁珠添加量为600μL,捕获时间为30 min,免疫磁珠捕获沙门氏菌具有特异性;用于检测牛奶和鸡蛋中的沙门氏菌时,将浓度为3 CFU/mL的沙门氏菌特异性富集后选择性增菌9h即可被MALDI-TOF MS准确鉴定。结论该方法具有选择性好,特异性高,耗时短,结果准确的优点,为食品中沙门氏菌的检测提供相关参考。     

国产沙门氏菌免疫磁珠的制备及其应用

目的优化免疫磁珠制备条件,获得捕获性能高、成本低的国产沙门氏菌免疫磁珠,为国产沙门氏菌免疫磁珠的产业化制备奠定基础。方法采用亚微米级羧基磁珠及沙门氏菌多克隆抗体,利用碳二亚胺缩合法制备2 mg级免疫磁珠。以目标菌捕获率、磁珠表面抗体偶联率为评价指标,对4种粒径(100、300、500、1000 nm)的磁珠原材料进行筛选;以目标菌捕获率、磁珠表面抗体偶联率、免疫磁珠表面FITC荧光强度为评价指标,对磁珠与抗体不同的投料比(100:1、100:1.5、100:2、100:2.5、100:3)进行优化;同时,对国产沙门氏菌免疫磁珠与进口免疫磁珠(Dynalbeads~?沙门氏菌免疫磁珠、Bac Trace~?沙门氏菌免疫磁珠)的性能进行比较分析,考察了捕获率、免疫磁珠与目标菌的结合情况、特异性捕获能力等,并在实际样品中进行了应用检测。结果以粒径为300 nm的磁珠为原材料制备的免疫磁珠对浓度为10~2 CFU/mL的目标菌的捕获率为99%、抗体偶联率为34.64%,明显高于其他粒径的免疫磁珠;当投料比为100:2(磁珠:抗体)时,制备的免疫磁珠对浓度为10~2 CFU/m L的目标菌的捕获率为100%,偶联率为52.34%,优于其他投料比;针对不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌(10~0~10~6 CFU/mL),国产免疫磁珠的捕获率高于进口免疫磁珠(国产:83%~100%;Dynalbeads~?:57%~74%;Bac Trace~?:9%~40%);在25 mL牛奶中添加(11.9±3.7)CFU鼠伤寒沙门氏标准菌株,国产沙门氏菌免疫磁珠的检出率高于进口免疫磁珠(国产:100%;Dynalbeads~?:70%;Bac Trace~?:40%)。结论优化了制备条件后所制备的国产沙门氏菌免疫磁珠的捕获能力强、价格低、能够实现大体积实际样品中痕量目标菌的100%检出,具有广阔的应用前景,本研究为沙门氏菌免疫磁珠的国产化应用提供了科学数据。