人乳铁蛋白基因山羊乳腺特异性表达载体的构建

人乳铁蛋白（human lactoferrin，hLf）是一种铁结合性糖蛋白，具有多种重要的生理功能，因其巨大的经济价值和使用价值而引起广泛关注。目前已在小鼠、奶牛、昆虫、烟草等系统中表达了重组的人乳铁蛋白。但生产的hLf远远不能满足市场需求，鉴于乳腺反应器的优越性，所以应用基因工程大量生产乳腺特异性表达的hLf具有重要的实际意义。本研究先将hLf进行分子克隆，然后经限制性内切酶PmeI切割和胶回收获得hLf片断，与此同时，将真核表达载体pBCI用限制性内切酶XhoI消化并进行末端修饰，然后将其与hLf片断进行连接，最后将连接产物转化大肠杆菌并筛选阳性重组子。经PCR鉴定和限制性内切酶分析，结果表明成功构建了含有山羊乳腺细胞特异性表达启动子β-casein promoter的人乳铁蛋白基因真核表达载体pBC I-hLf，这就为hLf在乳腺组织中的特异性表达奠定了基础。。     

老年患者血清NSE和S-100β蛋白水平变化与术后认知功能障碍的关系

目的观察老年患者手术前后血清神经元特异性烯醇化酶（NSE）及S-100β蛋白水平变化,探讨其与术后认知功能障碍（POCD）的关系。方法选择年龄≥60岁、择期手术患者120例,于术前、术毕、术后12、24、48 h测定血清NSE和S-100β蛋白水平;评估患者POCD发生情况;对POCD组和未发生认知功能障碍（NPCD）组手术前后血清NSE和S-100β蛋白水平变化进行比较。结果 120例患者血清NSE水平在术毕、术后12、24及48 h时均高于术前,血清S-100β蛋白水平在术毕时显著高于术前（P〈0.05或P〈0.01）;POCD组术毕、术后12 h血清NSE和S-100β蛋白水平显著高于NPCD组（均P〈0.01）。结论老年患者术后血清NSE及S-100β蛋白水平明显升高;老年患者术后血清NSE及S-100β蛋白水平升高与术后认知功能障碍发生有关。     

重组人凝血因子Ⅶ在Flp-In-CHO细胞中的表达及鉴定

目的利用Flp/FRT位点特异性重组技术,在Flp-In-CHO细胞中表达重组人凝血因子Ⅶ(rhFⅦ),并进行鉴定。方法用限制性内切酶EcoRⅠ和EcoRⅤ分别双酶切质粒pT-FⅦ与表达载体pcDNA5/FRT/TO,将回收的目的基因片段和载体片段连接,构建重组表达质粒pcDNA5/FRT/TO-FⅦ,并与辅助质粒pOG44共转染Flp-In-CHO细胞,经400μg/ml潮霉素B压力筛选,获得抗性细胞株。采用PCR、RT-PCR、Western blot和PT等方法对筛选出的细胞株分别进行基因组水平、mRNA水平、表达水平和蛋白活性的鉴定。结果重组表达质粒pcDNA5/FRT/TO-FⅦ经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确;筛选出9株抗性细胞;外源基因FⅦ定点整合到Flp-In-CHO细胞基因组中并得到表达;重组蛋白表现出与血浆FⅦ相一致的促凝活性。结论利用位点特异性表达系统Flp/FRT,在Flp-In-CHO细胞中成功表达了hFⅦ,为其制备和纯化奠定了基础。     

中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法的建立

目的建立中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法。方法参照已发表的中蜂囊状幼虫病毒(CSBV)基因序列,针对其结构蛋白基因设计1对特异性引物,提取感染CSBV的囊状幼虫RNA,反转录为cDNA,以其为模板,进行PCR扩增,对检测方法进行优化,验证该方法的特异性及敏感性,并对31份临床样品进行检测。结果所建立的CSBVRT-PCR检测方法特异性和敏感性良好,以含CSBV结构蛋白基因的重组质粒为模板,最低可检出10pgDNA。临床症状诊断和电镜观察均为阴性的22份样品经RT-PCR检测,有2份扩增出目的条带。结论已建立了中蜂囊状幼虫病毒RT-PCR检测方法,为CSBV检测、流行病学调查及动物模型的建立奠定了基础。     

重组抗人CD22嵌合抗体SM03的 125I标记及生物活性

为了探讨125I标记的重组抗人CD22嵌合抗体SM03的生物活性,采用Iodogen法进行单克隆抗体SM03的125I标记, Sephacryl S-300 HR色谱柱分离标记混合物,测定分离后样品的纯度与浓度.采用竞争结合法和酶联免疫吸附法(ELISA)测定纯化后样品的活性.抗体经过放射性标记后,放化纯度>99%,回收率>47%.125I-SM03的生物活性与未标记抗体差异没有显著性,P=0.907.用125I-SM03筛选CD22抗原表达量最多的细胞,在Raji、Daudi和Ramos细胞中,SM03与Ramos细胞的特异性结合量最多,每个细胞的结合量为1.3 pmol.以上结果表明,Indogen法可以用于单克隆抗体SM03的标记,标记后不影响SM03的生物活性.     

复合中草药对草鱼生长性能和非特异性免疫功能的影响

以复合中草药Ⅰ（广藿香、山楂、麦芽、砂仁）、复合中草药Ⅱ（广藿香、山楂、决明子）水煎剂按体积分数3%加入基础饲料中持续饲喂草鱼30、60 d,以饲喂基础饲料为对照组,探讨复合中草药对草鱼生长性能和非特异性免疫功能的影响。结果表明：与对照组相比,饲喂复合中草药Ⅱ 60 d,草鱼饵料系数显著降低;饲喂复合中草药Ⅰ、Ⅱ 30 d,草鱼肝脏谷胱甘肽过氧化物酶活力显著提高……     

鲍鱼内脏脂质增强免疫功能的初步研究

随着鲍鱼产业的快速发展,为了提高鲍鱼内脏的资源利用率,本文以鲍鱼内脏脂质为研究对象,设立低、中、高三个剂量组及阴性和阳性对照组,分析鲍鱼内脏脂质对小鼠特异性免疫和非特异性免疫的增强作用。研究结果表明,鲍鱼内脏脂质可显著增强小鼠的血清溶血素和抗体生成细胞水平,提高迟发性变态反应和脾淋巴细胞转化能力,增强腹腔巨噬细胞吞噬能力,鲍鱼内脏脂质通过提高小鼠特异性免疫和非特异性免疫进而增强小鼠的免疫功能。本研究为鲍鱼加工过程中所产生副产物的多元化开发和全值化利用提供了初步的理论依据。     

特异性检测、鉴别乳酸片球菌的引物探针及其应用

为解决现有方法在检测乳酸片球菌时表现出耗时长、检测不灵敏的缺点,拟制备并运用2对特异性引物探针快速准确地从复杂生境中检测乳酸片球菌。提取乳酸片球菌HP-B1099基因组DNA,通过4因素3水平正交实验寻找ERIC-PCR最佳反应程序,并得到乳酸片球菌有代表性的2条ERIC基因片段,设计获得2对引物探针1099-750-F/1099-750-R、1099-3-F/1099-3-R,并对2对引物的特异性、普适性、检测限度进行验证与检验。结果表明：基于ERIC-PCR技术设计的2对引物探针,可简便快速地实现混合样本中乳酸片球菌的检出,具有特异性、普适性的特点,并在多达8种基因组DNA或8种菌株混合样本中特异性地鉴别痕量乳酸片球菌,最终实现在多株近缘菌株或复杂生境中检出极低浓度的乳酸片球菌。     

利用种特异性PCR快速鉴定新疆酸马奶优势菌群

建立了一种快速准确鉴定酸马奶中乳酸菌优势菌群的种特异性PCR技术。据资料报道,酸马奶中已知的6种优势菌主要集中在植物乳杆菌、干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌3大类群。首先,针对属于同一类群内的两种优势菌设计2对种特异性引物,采用3组PCR实验验证引物的特异性。然后以酸马奶中提取的总DNA为模板,利用经验证的6对种特异性引物鉴定2份新疆酸马奶样品中的优势菌群。结果表明,新疆酸马奶中含有Lactobacillus(L.)helveticus,L.pentosus,L.plantarum,L.acidophilus和L.paracasei,与前人报道结果一致。本研究建立的种特异性PCR技术不仅能够快速鉴定酸马奶中乳酸菌优势菌群组成,同时可为其它发酵制品中3大类群乳酸菌鉴定提供有效的方法。     

失眠患者神经损伤标志物水平变化研究

目的:检测失眠患者神经损伤标志物水平变化,为失眠发病机制的探索提供新的思路。方法:104例失眠患者,按照其治疗情况分为初诊组(n=66)、复诊组(n=38),并选取同期30名健康体检者纳入对照组。检测三组受试者血清神经丝重链(NfH)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、S100钙结合蛋白B(S100B)水平,并分析上述神经损伤标志物与受试者多导睡眠图(PSG)参数的相关性。结果:初诊组NfH高于复诊组,NSE高于复诊组合对照组,初诊组、复诊组血清NfH、S100B均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),复诊组与对照组血清NSE水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。初诊组睡眠潜伏期高于复诊组,其睡眠效率低于复诊组、对照组,初诊组、复诊组睡眠潜伏期高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),三组受试者总睡眠时间、REM期睡眠时间、REM%、N3期睡眠时间、N3%比较,差异无统计学意义(P>0.05)。相关性分析显示NfH与睡眠潜伏期呈正相关,NSE与睡眠效率呈负正相关(P<0.05)。结论:失眠患者血清NfH、NSE、S100B均显著升高,经治疗后,患者血清NfH、NSE明显降低且PSG参数有所改善,神经损伤标志物与患者病情变化具有密切关联。