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501.
目的:研制可作为β-内酰胺类抗生素耐药编码基因检测质控用标准样品。方法:通过检索National Center for Biotechnology Information(NCBI)基因库,获得β-内酰胺类抗生素耐药性编码基因blaTEM、blaPSE、blaCTX-M、blaCMY和blaOXA的DNA序列,构建耐药基因重组质粒和工程菌。将工程菌传代培养15代,同时使用PCR扩增和DNA测序测定确认目标基因的遗传稳定性。大量制备菌悬液,提取重组质粒,真空干燥得到质粒标准样品。使用PCR和RT-qPCR检测质粒标准样品的最低检出限。使用超微量分光光度计测定质粒标准样品的质量,RT-qPCR测定质粒作为模板扩增时的Ct值,以此评价标准样品的均匀性及贮藏稳定性。结果:5种重组质粒DNA可在工程菌中稳定遗传且无突变发生。成功制备5种质粒DNA标准样品,均匀性良好。各质粒DNA经梯度稀释后,PCR最低检出限在2.33×104-2.25×106 拷贝数/μL之间,RT-qPCR最低检出限在1.93-1850 拷贝数/μL之间。样品在37 ℃贮存14 d、4 ℃贮存3个月、-20 ℃贮存12个月稳定 性良好。结论:研究制备得到β-内酰胺类抗生素耐药机制编码基因blaTEM、blaPSE、blaCTX-M、blaCMY、blaOXA质粒DNA标准样品,目的基因遗传稳定性、标准样品的均匀性和贮存稳定性良好。 相似文献
502.
目的建立重组人组织型纤溶酶原激活剂(tissue type plasminogen activator,tPA)改构体(TNK-tPA)的质控方法。方法采用气泡法测定TNK-tPA原液的生物学活性,非还原SDS-PAGE和RP-HPLC法测定其纯度,还原型SDS-PAGE确定其相对分子质量,HPLC-SEC法测定其单链含量,胰酶裂解法分析其肽图,Edman降解法测定其N-末端氨基酸序列,毛细管等电聚焦电泳法测定其等电点,Lowrry法测定其蛋白质含量,地高辛法测定其外源DNA残留量。按《中国药典》三部(2005版)要求,对TNK-tPA成品进行鉴别试验及外观、pH值、水分含量、无菌、装量、异常毒性等检测。结果 3批TNK-tPA原液的生物学活性为(2.09~2.16)×106U/ml,比活性均大于3.5×105U/mg,因此确定TNK-tPA原液的比活性不得低于3.0×105U/mg。3批TNK-tPA原液的非还原型SDS-PAGE纯度均大于98.0%,RP-HPLC纯度均大于97.0%;经还原型SDS-PAGE分析可见两条带,相对分子质量分别为68 000和35 000;样品原液的单链含量为75.7%;3批TNK-tPA原液的肽图酶切图谱与理化参考品一致;TNK-tPA原液的N-末端氨基酸序列、等电点、蛋白质含量、外源DNA残留量及成品的鉴别试验结果、外观、pH值、水分含量、无菌、装量、异常毒性等均符合《中国药典》三部(2005版)要求。结论建立的质控方法可保证产品安全、有效、质量可控,可用于TNK-tPA产品的常规检定。 相似文献
503.
高效液相色谱法测定重组人干扰素α1b滴眼液中苯扎氯铵的含量 总被引:1,自引:0,他引:1
目的采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)测定重组人干扰素α1b(recombi-nant human interferonα1b,rhIFNα1b)滴眼液中苯扎氯铵(benzalkonium chloride)的含量。方法采用HPLC法测定rhIFNα1b滴眼液中苯扎氯铵含量,色谱条件:流动相:乙腈:5 mmol/L醋酸铵[含1%三乙胺,用冰醋酸调节pH值至(5.0±0.2)]体积比为65∶35;流速:1.0 ml/min;检测波长:262 nm;进样量20μl;柱温:室温。对该方法进行验证,并应用该方法检测3批rhIFNα1b滴眼液中苯扎氯铵的含量。结果该方法检测苯扎氯铵专属性和系统适应性良好;最低检测限和定量限分别为0.53μg/ml和1.48μg/ml;苯扎氯铵在10~50μg/ml浓度范围内,标准曲线的线性关系良好,R2=0.999 1;连续6次进样,峰面积的RSD=1.78%;苯扎氯铵理论浓度为22、24、26μg/ml的加样回收率平均为97.90%,RSD=0.96%。3批rhIFNα1b滴眼液中苯扎氯铵的相对含量分别为19.27、19.89和19.76μg/ml,分别为标示量的96.34%、94.46%和98.80%。结论 HPLC法简便、灵敏、准确,可用于测定rhIFNα1b滴眼液中苯扎氯铵的含量。 相似文献
504.
目的探讨骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)9-2双表达定向诱导多潜能干细胞C3H10向成骨细胞分化的情况。方法将C3H10细胞分为4组:BMP9-2、BMP2、BMP9和GFP组,将4种重组腺病毒分别感染C3H10细胞,通过碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)染色、定量测定及钙茜素红染色,观察BMP9-2双表达对C3H10细胞成骨分化的定向诱导作用。结果 BMP9-2双表达能诱导C3H10细胞ALP的表达,其染色活性高于BMP2组1.6倍,BMP9组2.5倍,GFP组4倍;其BMP9-2双表达定量表达A520值在病毒感染后5、7、9 d均高于BMP2、BMP9和GFP组;BMP9-2双表达能诱导C3H10细胞钙盐的沉积,感染14 d后,钙茜素红染色可见钙化结节,其染色活性高于BMP2组1.4倍,BMP9组1.3倍,GFP组5.2倍。结论 BMP9-2双表达能定向诱导C3H10细胞成骨分化,其成骨活性强于单一成骨诱导因子BMP2和BMP9。 相似文献
505.
表达轮状病毒VP4抗原的重组腺病毒对新生小鼠的被动免疫保护作用 总被引:2,自引:1,他引:2
目的探讨表达轮状病毒VP4抗原的重组腺病毒(Ad5/VP4)对新生小鼠的被动免疫保护作用。方法在293细胞上扩增表达猴轮状病毒SA11株VP4抗原的重组腺病毒并纯化。将轮状病毒抗体阴性的小鼠交配后的雌性小鼠,分别通过肌肉注射、滴鼻和口服免疫纯化后的重组腺病毒,生产后第7天和第8天,用轮状病毒SA11(1·0×106PFU)口服攻击乳鼠2次,观察出现腹泻症状的乳鼠的比例,并用ELISA检测母鼠的血清以及乳鼠胃囊乳块中的轮状病毒特异性抗体。同时以含有部分E1区基因的腺病毒5型载体(Ad5)作为对照。结果经3种不同途径免疫母鼠后,在血清和乳汁中均能检测到轮状病毒VP4特异性抗体。经滴鼻免疫的母鼠喂养的乳鼠,经攻击后保护率为100%(11/11);经肌肉注射免疫的母鼠喂养的乳鼠,经攻击后保护率为30%(3/10);经口服免疫的母鼠喂养的乳鼠,经轮状病毒攻击后保护率为80%(8/10)。对照组的小鼠全部出现了腹泻症状。结论表达轮状病毒VP4抗原的重组腺病毒经滴鼻免疫母鼠后,能在乳汁中产生特异性的IgA和IgG抗体,并能保护新生小鼠对抗轮状病毒的攻击,保护率达100%。 相似文献
506.
507.
目的评估国产重组人粒细胞刺激因子(recombinant human granulocyte colony-stimulating factor,rhG-CSF)注射液比活性的总体水平。方法收集2009及2017年国家抽验性评价部分批次rhG-CSF样品的比活性数据,并与近5年进口注册检验部分批次rhG-CSF样品进行比较分析。结果 2009部分批次rhG-CSF样品比活性均值为0. 74×108IU/mg,标准差为0. 10×108IU/mg;2017部分批次rhG-CSF样品比活性均值为0. 83×108IU/mg,标准差为0. 15×108IU/mg;进口注册批次比活性数据的均值为0. 93×108IU/mg,标准差为0. 17×108IU/mg。结论国产rhG-CSF注射液质量不断提升,与进口制品间的差距在逐渐缩小,部分企业制品的质量已达到进口药品水平。 相似文献
508.
目的建立重组人尿激酶原的质控方法和质量标准。方法以纤维蛋白平板法测定重组人尿激酶原的生物学活性,S-2444发色底物法测定单双链比例,还原型SDS-PAGE测定相对分子质量,SDS-PAGE和分子筛色谱测定纯度,毛细管电泳法测定等电点,胰蛋白酶酶切后分析肽图,其余检测项目按《中国药典》三部(2005版)规定进行。结果用建立的方法对原液和成品进行了检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》三部(2005版)的要求。结论所建立的质控方法和质量标准可用于重组人尿激酶原产品的常规检定。 相似文献
509.
目的观察重组酵母乙型肝炎疫苗(60μg)抗-HBs阳转率及接种反应。方法对河北省承德市滦平县89名(男52名,女37名)因按常规免疫程序(0、1、6)接种重组酵母乙肝疫苗(10μg)未产生免疫应答者重新接种重组酵母乙型肝炎疫苗(60μg)2针次,间隔4周。分别于末次免疫后1和6个月采血,分离血清,采用乳胶化学检测法检测抗-HBs水平,并计算阳转率;分别于首次和末次免疫后30 min及72 h内,观察局部(疼痛、瘙痒、硬结)和全身(发热、乏力、腹泻)不良反应。结果末次免疫后1个月,男性抗-HBs阳转率为96%,女性为97%,末次免疫后6个月,男性抗-HBs阳转率为98%,女性为100%,男女抗-HBs阳转率差异均无统计学意义(P>0.05),免疫2针次后,抗-HBs阳转率接近100%。首次和末次免疫后30 min及72 h内,局部和全身不良反应发生率均未超过6%。结论重组酵母乙型肝炎疫苗(60μg)可提高按常规程序接种乙肝疫苗未产生免疫应答人群的抗-HBs阳转率,且疫苗接种后局部和全身不良反应发生率较低,可推广使用。 相似文献
510.
目的构建重组乙型肝炎表面抗原(HBsAg)分泌型汉逊酵母工程菌株,并进行诱导表达。方法在HBsAg基因前加酿酒酵母α前导肽(MFα)基因序列作为信号肽,将整个序列优化为汉逊酵母优选密码子,采用搭桥PCR方法分别合成后,通过1对引物PCR法融合在一起。将融合基因插入汉逊酵母穿梭质粒pDGXHP2.0的甲醇氧化酶基因(MOX)启动子下游,构建成多拷贝分泌型重组表达载体。将其电转化多型汉逊酵母尿嘧啶缺陷型宿主菌ATCC34438(Ura3-),筛选分泌表达HBsAg的汉逊酵母工程菌株,并比较在YPD、BMMY、MM3种培养基中分泌表达HBsAg的水平,ELISA检测培养上清液中HBsAg的表达量,透射电镜观察类病毒颗粒(VLPs)。结果构建了HBsAg汉逊酵母多拷贝表达质粒pDGXHP2.0-2MFα-HBsAg和pDGXHP2.0-4MFα-HBsAg,筛选获得了分泌表达HBsAg的汉逊酵母HP/2MFα-HBsAg和HP/4MFα-HBsAg。经诱导,工程菌株在YPD培养基中分泌表达的HBsAg量高于在BMMY和MM中的表达量;ELISA定量检测表达量最高可达10μg/ml,培养上清液经透射电镜观察,形成了VLPs。结论HBsAg在汉逊酵母中能够分泌表达,并能形成VLPs,但表达量低于胞内表达量。 相似文献