谷氨酸棒杆菌产L-色氨酸重组菌株的构建

在芳香族氨基酸合成途径中,由分支酸产生两个分支:一方面,在邻氨基苯甲酸异构酶(ANS)、邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶(PRT)和色氨酸合成酶(TS)的催化下合成色氨酸;另一方面,分支酸在分支酸变位酶(CM)的催化下生成预苯酸(PPA),由预苯酸又产生两个分支,最后生成酪氨酸或苯丙氨酸。在该途径中,3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7磷酸合成酶(DS)是关键酶。以谷氨酸棒杆菌SPT9(Phe-、Tyr-、4-FPr、6-FTr)为出发菌株,通过同源重组敲除分支酸变位酶基因csm获得菌株SPT9?csm。将编码DS、ANS和PRT、TS的基因aroⅡ、trpEGD及ts在SPT9?csm中分别过量表达和串联过量表达,获得一系列重组菌:SPT9?csm-XK99E-aroⅡ-trpEGD、SPT9?csm-XK99E-ts、SPT9?csm-XK99E-cspB-ts、SPT9?csm-mob2-ts和SPT9?csm-mob2-ts-aroⅡ-trpEGD。这五株菌摇瓶发酵72 h后,色氨酸产量相对于出发菌株SPT9分别提高了21.4%、57.1%、100%、121.4%和178.6%。通过实时荧光定量PCR检测表明,ts、aroⅡ和trpEGD基因在重组菌SPT9?csm-mob2-ts-aroⅡ-trpEGD中的表达量是它们在菌株SPT9中的9.2倍、13.0倍以及10.6倍。     

γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp改善斑马鱼焦虑样行为及五羟色胺合成的作用机制

该研究探讨了γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp（EnW）及其四种肽单体（γ-Glu-Trp、γ-[Glu]2-Trp、γ-[Glu]3-Trp和γ-[Glu]4-Trp）改善斑马鱼焦虑样行为和五羟色胺（Serotonin,5-HT）合成的作用机制。EnW及其肽单体均采用水溶给药的方式处理斑马鱼（低剂量56 μg/mL、高剂量500 μg/mL）,各供试品处理2周后开始行为学和生化指标测试。与正常对照组相比,行为学研究结果表明EnW及其肽单体均能够增加斑马鱼黑白偏好实验中明区停留时间百分比、新鱼缸实验中上下穿梭次数和鱼缸上半部分停留时间百分比,其中γ-Glu-Trp组斑马明区停留时间百分比（41.66%）、上下穿梭次数（25.83次）和鱼缸上半部分的停留时间百分比（38.95%）增加最显著（p<0.05）;此外,生化指标测定结果表明EnW及其肽单体增加了斑马鱼大脑组织色氨酸（Trp）浓度、色氨酸羟化酶活性和5-HT水平。综上所述,EnW及其肽单体作为Trp的直接来源改善斑马鱼焦虑样行为的可能作用机制是通过增加大脑组织Trp浓度,上调Trp-5-HT代谢途径进而增加神经递质5-HT的合成而发挥作用,从而证明膳食补充EnW及其肽单体具有预防和改善焦虑的作用。     

L-色氨酸产生菌分批发酵动力学模型

基于 3 0L的发酵罐分批发酵实验数据 ,根据已建立的L 色氨酸发酵数学模型 ,应用MATLAB软件对模型进行最优参数估计和非线性曲线拟合 ,得到的结果相对误差较小 ,所建立的分批发酵动力学模型能较好地反映L 色氨酸分批发酵的过程     

有机氮源对L-色氨酸发酵的影响

以L-色氨酸生产菌Escherichia coli TRP03为供试菌株,研究了多种有机氮源对L-色氨酸发酵的影响。 首先对不同来源的酵母 粉进行了优化试验,确定一种最优酵母粉,摇瓶发酵时L-色氨酸可积累10.21g/L;利用5 L发酵罐发酵1.5～3.0h时,细胞出现二次生 长现象,选择添加氨基酸粉和氯化胆碱促进细胞生长,经优化实验,确定同时添加氨基酸粉2g/L、氯化胆碱0.5g/L可在很大程度上解 决细胞的二次生长问题并提高L-色氨酸产量至44.21g/L;为提高中后期菌体活力及产酸能力,选择在不同发酵时期流加质量浓度为 1g/L的酵母粉、蛋氨酸及谷氨酰胺混合液,确定10h流加时,中后期的活细胞数提高了30.18%,保证了菌体活力。菌株E. coli TRP03经36h发酵,可积累L-色氨酸51.23g/L,较未经任何优化的菌株提高41.91%。     

膳食色氨酸对小鼠摄食量和下丘脑5-HT含量的影响

目的:主要研究饲料中不同水平色氨酸对小鼠的摄食量、体增重情况、血浆游离色氨酸、下丘脑中5-羟色胺(5-HT)含量的影响及其之间的联系。方法:将80只昆明雄性小鼠随机分为4大组,分别饲喂4种不同色氨酸水平的饲料(每千克饲料中分别含1.2、1.6、2.0、2.4g色氨酸)。28d后,将饲喂同一水平色氨酸饲料的小鼠分为2组,分别腹腔注射生理盐水和300mg/kg剂量BCAA溶液(control组和BCAA组),90min后处死,测其相应指标。结果:随着小鼠饲料中色氨酸水平的提高,下丘脑中5-HT含量增加而小鼠的摄食量随之降低。小鼠饲料中色氨酸水平、下丘脑中5-HT含量呈正相关,而这二者与与小鼠的摄食量呈负相关;BCAA组的小鼠血液Trp/BCAA、下丘脑中5-HT含量与对照组没有明显差别。结论:饲料中色氨酸可能是通过影响小鼠下丘脑中5-HT的含量,从而影响小鼠的摄食量;300mg/kg剂量BCAA溶液对小鼠下丘脑中5-HT含量没有显著影响。     

基于手性功能单体的L-色氨酸分子印迹复合膜的研制及性能研究

以L-色氨酸为印迹分子,S-2-巯基丙酸为手性功能单体,分别制备了25个L-色氨酸分子印迹复合膜(MICM_1~25)及相应的非印迹复合膜(NICM_1~25)。采用扫描电镜(SEM)表征最优印迹复合膜(MICM₅)及相应的非印迹复合膜(NICM₅)的外观形态,通过等温吸附模型对印迹复合膜的吸附性能进行评价,并结合高效液相色谱法(HPLC法)分析MICM₅对外消旋体DL-色氨酸的手性拆分能力。结果表明:以聚四氟乙烯膜为支撑膜,印迹分子、功能单体和交联剂的摩尔比为1∶8∶90,甲醇∶水(1∶1,体积比)为致孔剂可制备出较优的分子印迹复合膜,其对外消旋体DL-色氨酸有较好的手性拆分能力,拆分因子达到2.41。相对于常用功能单体制备的L-色氨酸分子印迹复合膜,采用S-2-巯基丙酸为手性功能单体制备的L-色氨酸分子印迹复合膜具有更高的亲和性和更好的手性拆分能力。     

γ-谷氨酰转肽酶的酶学性质及其转肽反应机制

γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,GGT)能专一地催化γ-谷氨酰基的转移,在γ-谷氨酰基类衍生物的合成方面具有重要的应用价值.今利用Bacillus subtilis NX-2发酵生产GGT,上清液中的GGT经硫酸铵沉淀后,以DEAE Sepharose FF和 Source 15 Q 两步离子交换进行纯化.以γ-D-Gln-L-Trp(SCV-07)为目的产物,研究了GGT的基本酶学性质,确定了其最适反应温度为40 ℃,最适Ph值10.0, 供体/受体浓度为5:7,最适反应时间为4 h,产物转化率可高达42%.结合反应进程曲线,分析了GGT的作用机制,并通过实验证实了GGT不仅具有转肽活性,还可催化产物的不可逆水解,这是导致产物回收率下降的关键原因.经测定得到GGT的转肽反应米氏常数(Km)为5.08 mmol·L-1,最大反应速率(rmax)为0.034 mmol·(min·L)-1;对γ-D-Gln-L-Trp的水解反应米氏常数(Km')为2.267 mmol·L-1,最大反应速率(rmax')为0.012 mmol·(min·L)-1.     

色氨酸操纵子系统的数值分析

研究色氨酸操纵子系统的分支问题。首先介绍该模型的建立过程,然后通过分析系统关于正平衡点的线性变分方程的特征根来研究系统在正平衡点的稳定性,应用泛函微分方程的局部Hopf分支理论给出了该模型出现周期解的条件,并利用正规型方法和中心流形理论得到了描述系统在第一个分支点出现的Hopf分支的分支方向和分支周期解稳定性的计算公式,最后通过数值模拟进行验证。     

复方氨基酸注射液（17AA-I）生产过程中活性炭对色氨酸含量的影响

探讨复方氨基酸注射液（17AA-I）生产过程中使用不同厂家活性炭对吸附色氨酸的程度确定对应的投料量。通过使用不同厂家活性炭、同厂家不同批号活性炭加入前后对色氨酸的吸附，确定工艺符合性。结果表明，复方氨基酸注射液（17AA-I）配制时加入不同厂家活性炭，对稀配中间产品中色氨酸的吸附有明显的差异。在复方氨基酸注射液（17AA-I）生产过程中，中间产品色氨酸含量应随着活性炭厂家的变更同步进行工艺验证，并同时确定对应色氨酸的投料量，制定不同的生产工艺，稳定产品质量。     

磷酸盐和pH值协同调控大肠杆菌发酵合成5-羟基色氨酸

为了提高大肠杆菌合成5-羟基色氨酸能力，该研究设计构建了pSTV28-TPH150过表达质粒，增强了羟化酶基因TPH150的表达，以HTP10为出发菌株(代谢工程实验室保藏，专利号：CN202110714155.1),电转化pSTV28-TPH150质粒得到菌株HTP10-1,发酵结果显示，存在副产物L-色氨酸积累过多，质粒不稳定等问题，因此在初始发酵工艺的基础上，通过设计4个pH梯度进行发酵对比试验和4种不同磷酸二氢钾流加策略来探究最适发酵工艺。实验结果表明，在菌株HTP10-1发酵pH值为6.7,并于发酵培养基中添加1 g/L磷酸二氢钾，葡萄糖补料瓶中添加3 g/L磷酸二氢钾时，菌体比生长速率达到最优，发酵结束后5-羟基色氨酸积累量最高达到5.46 g/L,副产物L-色氨酸积累量减少到1.37 g/L,质粒丢失率较对照组减少32%,极大地提高了菌株HTP10-1的质粒稳定性，验证了磷酸盐与发酵pH调控菌体生长的可行性，对质粒工程菌的发酵控制具有重要参考意义。