哈茨木霉UBc基因的克隆及表达

筛选哈茨木霉的cDNA文库,克隆到泛素结合酶基因的cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析,该序列的长度为951 bp,包含一个455 bp的完整开放阅读框,编码157个氨基酸,其理论分子量为17.64ku.在氨基酸水平上,具有较高的保守性.以克隆载体pBK5313为模板,设计含有XhoI和BamH I酶切位点的引物,成功地获得包含完整阅读框的目的基因;将目的基因连接到表达载体pET28上,构建出含有泛素结合酶基因的重组子pET28-UBc,转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,成功地获得了大量的大肠杆菌转化子.通过对大肠杆菌转化子菌落PCR检验、质粒双酶切鉴定及测序分析,证实了成功转化.通过IPTG诱导,优化了泛素结合酶原核表达的条件,最佳诱导时间为4 h,诱导剂浓度对蛋白表达量影响不大.本研究为进一步研究哈茨木霉的生物防治作用机制,诠释蛋白质代谢途径提供基本技术支持.     

哈茨木霉cDNA文库构建及表达序列标签分析

为了从分子水平上研究哈茨木霉的生物防治作用机制,构建了哈茨木霉菌丝体时期的cDNA文库并随机挑选部分克隆进行了测序分析.所构建的文库滴度为1.2×106pfu/m l,重组率为93%,插入片断平均长度>1.2 kb.对随机挑选的305条ESTs测序分析,其中67条EST为已知基因,58条为已知EST,其余的180条为新EST.在已知基因中,有9条ESTs与生物防治相关.从对文库的初步检验结果看,文库具有良好的质量,符合大规模测序的标准.通过ESTs研究是获得功能基因的有效手段.     

哈茨木霉Chiv基因的原核表达及优化

通过筛选哈茨木霉的DNA文库,克隆到Chiv基因的cDNA全长序列.以连接有哈茨木霉Chiv基因的质粒pBK902为模板,设计含有EcoRI和XhoI酶切位点引物,采用PCR方法扩增得到具有完整开放阅读框的目的基因;将目的基因连接到表达载体pET28上并转化大肠杆菌BL21菌株中,成功地获得了大量的阳性转化子.质粒通过EcoRI和XhoI酶切鉴定及测序鉴定,证明Chiv基因成功地转化到大肠杆菌中.重组大肠杆菌经IPTG诱导表达及SDS-PAGE检测后,发现特异的蛋白表达条带,其分子量为50 kDa左右.通过对诱导剂量与诱导时间等因素的优化,结果显示几丁质酶的最佳诱导时间为13 h,最佳诱导剂浓度为1 mM,为几丁质酶的工业化生产奠定基础.