鼠李糖乳杆菌对河豚毒素的免疫活性消减作用方式

为探究鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）对河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）免疫活性的消减作用方式和可能作用位点，分别采用活化、热灭活和破碎的鼠李糖乳杆菌以及去除胞外多糖、原生质体、细胞壁和肽聚糖的分离样品，与TTX标准品在37 ℃孵育1 h，使用竞争性酶联免疫吸附法分析作用前后TTX的免疫活性变化。通过化学处理掩蔽鼠李糖乳杆菌表面的羧基和氨基，采用傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）分析菌体表面的化学键振动类型和官能团变化情况。结果发现，活化、热灭活和破碎后的鼠李糖乳杆菌均可消减TTX的免疫活性，因此TTX免疫活性的变化和鼠李糖乳杆菌的活性无关。各分离样品对TTX的消减作用表明肽聚糖成分对TTX免疫活性的消减率最高可达到47%。FTIR分析发现鼠李糖乳杆菌表面羧基掩蔽后可显著降低TTX免疫活性的消减率至18%，而掩蔽氨基则对作用前后的TTX消减率影响无显著差异（P＞0.05）。实验表明，消减TTX免疫活性的原因可能为TTX与鼠李糖乳杆菌表面肽聚糖上的羧基结合。     

副溶血性弧菌拮抗菌的筛选鉴定及抑菌物质特性研究

为获取既可抑制食源性致病菌又可抑制水产致病菌的益生菌株,以人畜共患致病菌副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus ATCC17802)为指示菌,采用点种法初筛以及打孔扩散法复筛,得到1株来源于上海东海海水的H19菌株,其抑菌物抑菌圈直径达(17.16±0.28)mm。通过形态观察及16SrDNA序列分析可知,菌株H19为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis H19,GenBank登录号:MG383451)。将菌株H19进行抑菌谱试验,探究菌株H19抑菌物的理化性质,并且抑菌物通过硫酸铵沉淀及不同孔径透析袋截留粗提,粗提物经蛋白酶处理及Tricine-SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳可知,该抑菌物具有广谱抑菌活性,既可抑制革兰氏阳性菌又可抑制大部分革兰氏阴性菌,且具有较好的热、pH以及紫外线稳定性,该抑菌物可能为2种新型抗菌肽,分子量分别在6.5~9.5kDa以及27.0~35.0kDa。由此可见,枯草芽孢杆菌H19所产抗菌肽具有防治食源性疾病以及水产疾病的应用潜力。     

利用柿子皮混菌发酵制备果醋及品质分析

以柿子加工副产物柿子皮为主要原料,采用氧化葡萄糖酸杆菌、植物乳杆菌、明串珠菌发酵酿造果醋。通过单一菌种、多菌组合的发酵实验,以发酵时间和产品质量为指标,确定混合菌种发酵的最佳组合。采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术鉴定了最佳醋品的挥发性香气成分,采用反相高效液相色谱法测定了主要有机酸含量。结果表明：当V（氧化葡萄糖酸杆菌）∶V（植物乳杆菌）＝1∶1时,醋品品质最佳,发酵时间6 d,感官品评94.90 分,共鉴定出51 种挥发性香气成分,主要为醇类和酯类,有机酸中乳酸和乙酸为主要有机酸,柿香味和醋香浓郁、协调,口感佳,品质优。     

异甘露聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质分析

以pET-30(a)为表达载体,将来源于枯草芽孢杆菌K-6(Bacillus subtilis K-6)的异甘露聚糖酶基因(isoman K-6)在Escherichia coli BL21(DE3)中进行了表达。Isoman K-6登录号为HQ902141,基因全长为1083bp,共编码360个氨基酸,工程菌酶活为415.9U/mL,SDS-PAGE电泳表明,工程酶ISOMAN K-6分子量约为45000u,与预期分子量相符。经IDAHisBind树脂柱纯化的纯酶酶学性质研究表明,该重组酶为金属酶,Al3+和Ba2+对其有很强的激活作用,其最适反应温度为55℃、最适pH为6.0,且在pH4.5~7之间有着较好的稳定性,以槐豆胶为底物时,Vmax和Km分别为1.3U/mL和7.3mg/mL。     

重组褐藻胶裂解酶基因工程菌的高密度培养

在5L发酵罐中,利用分批补料培养技术高密度培养含表达褐藻胶裂解酶重组质粒的工程菌E.coli BL21,生产褐藻胶裂解酶.利用单因素实验对补料培养基中碳源浓度进行优化,利用单因素实验和单纯形优化法对诱导时间和IPTG浓度进行了优化,从而得到最适高密度发酵条件为:发酵培养基为葡萄糖10g/L,酵母提取物5g/L,蛋白胨20g/L;补料培养基为葡萄糖150g/L,蛋白胨20g/L,酵母提取物10g/L,4～10h的流加速率为100mL/h,10～16h的加速率设定为200mL/h;诱导时间为4.5h,IPTG终浓度为0.60mmol/L,发酵过程中溶解氧控制在30％ ～40％,pH控制在7.0～7.2.IPTG未诱导时,最终发酵液中菌液稀释200倍后,OD600达0.696,菌体浓度达65.38g/L;IPTG诱导后菌液稀释200倍后,OD600达0.457,菌体浓度达60.15g/L,是分批发酵的8.43倍;菌体进行超声波破碎后制备粗酶液,酶活力达26.37U/mL,是分批发酵的5.48倍.     

甘露聚糖酶产生菌F1-5的鉴定及发酵条件研究

本研究从实验室保藏高效分泌能降解异甘露聚糖的甘露聚糖酶的细菌F1-5 出发,采用菌株的个体和群体的形态观察、生理生化实验及16S rDNA 系统发育分析手段进行鉴定,最终确定菌株F1-5 为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。Genbank 注册号为FJ392725。通过单因素试验和正交优化试验,确定枯草芽孢杆菌F1-5 的最佳发酵产酶条件。酵母细胞壁碳源浓度为4.8%,氮源浓度为0.5%,培养基初始pH6.0,接种量为6%,装液量为60ml/250ml三角瓶,转速为180r/min,培养温度为35℃,在此发酵条件下发酵48h,枯草芽孢杆菌F1-5 产生的甘露聚糖酶活力达330U/ml,是优化前的3.4 倍。发酵罐扩大实验,甘露聚糖酶活力可达582U/ml。     

鼠李糖乳酸杆菌对河豚肝脏中河豚毒素毒性的影响

以野生河豚肝脏中的河豚毒素（tetrodotoxin,TTX）为研究对象,研究活化与热灭活处理的鼠李糖乳杆菌对其毒性的消减作用。将活化的与热灭活处理的鼠李糖乳杆菌作为材料对TTX进行脱除,采用酶联免疫吸附剂测定（enzyme-linked immunosorbnent assay,ELISA）、层析试纸检测和小鼠生物法分析TTX消减率的变化,采用气相色谱-质谱分析发酵处理后的肝脏二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid,EPA）与二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid,DHA）含量变化。竞争性ELISA结果显示加热灭活后的鼠李糖乳杆菌对TTX的消减率高达82.16%;而未经灭活处理的鼠李糖乳杆菌对TTX的消减率为70.05%,表明热灭活处理的鼠李糖乳杆菌消减效果更佳。此外,经鼠李糖乳杆菌发酵7 d后野生河豚肝脏的TTX消减率为93.27%,气相色谱-质谱检测结果显示发酵后肝脏内的EPA与DHA含量分别减少了11.93%、22.50%。综上所述,鼠李糖乳杆菌能消减河豚肝脏中的TTX,经鼠李糖乳杆菌发酵处理后消减效果更佳,本研究结果可为河豚内脏组织的毒性消减提供参考。     

一株后生元菌株的抑菌特性研究及其细菌素基因簇的挖掘

本文旨在筛选一株可拮抗中国大鲵源嗜水气单胞菌的后生元菌株,并对其进行抑菌特性的研究和细菌素基因簇的挖掘。以中国大鲵病原性嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila, Ah2）为指示菌,筛选一株产细菌素乳酸菌株并评估其药敏特性;采用有机溶剂萃取法初步纯化菌株产细菌素;通过pH、温度和消化酶耐受性、贮藏稳定性、抑菌谱及最小抑菌（MIC）和杀菌浓度（MBC）共六类指标评价细菌素的抑菌特性;溶血反应与细胞毒性实验测试细菌素对Ah2的抑菌效果,经扫描电子显微镜初步探究细菌素的抑菌机制;经由紫外全波长扫描定性细菌素以及Tricine-SDS-PAGE电泳测定细菌素的分子量范围;最后根据菌株的全基因组序列挖掘其潜在的细菌素基因簇（RiPPs）。结果显示,从青岛市售腐乳中筛出一株产细菌素植物乳植物杆菌M4L1（Lactiplantibacillus plantarum M4L1）。初步纯化M4L1产细菌素并命名为LP01。细菌素LP01具备良好的消化酶耐受性,且在pH2~10、?20~121 ℃和9个月贮藏期内均表现出稳定的抑菌活性,并对单增李斯特菌、弗氏柠檬酸杆菌等14株革兰氏阳性和阴性菌均有不同程度的抑制作用;另外,LP01对Ah2的MIC和MBC分别为12.94和25.88 μg/mL。经MBC浓度的LP01处理后的Ah2,溶血活性和细胞毒性均得到明显缓解;SEM观察其通过破坏Ah2的细胞壁具有抑制或杀伤作用。LP01在波长200~220 nm处的肽类特征吸收峰显著,电泳后条带显示其分子量在3.3~4.0 kDa,LP01为小分子肽类细菌素。此外,基因注释到M4L1有2个细菌素基因簇（RiPPs）,对应产物分别为Plantaricin K和Plantaricin E,均属于植物乳杆菌II类细菌素。菌株M4L1不仅含有多种抗菌物质相关基因簇,而且其细菌素LP01具备了优良的抑菌性能,能有效抑制多种水产病原菌、食物腐败菌及食源性致病菌等。产细菌素植物乳植物杆菌M4L1作为一株潜在的后生元菌株具有较好的应用前景。     

混菌发酵对苹果酒香气物质及发酵效率的影响

本文研究通过法尔皮有孢汉生酵母(Hanseniasporavalbyensis)和酵母属酵母(Saccharomycescerevisiae)顺序混菌发酵增加苹果酒的风味酯含量和保证苹果酒发酵的发酵效率。方差分析表明两种酵母接种量及该两种接种量的交互因素对混菌发酵效率有显著性影响;对接种量、苹果汁营养条件进行正交试验确定了一种适宜条件,在该条件下,混和酵母具有法尔皮有孢汉生酵母高产酯能力特性和酵母属酵母高发酵效率特性:在15℃下,发酵时间为31d,发酵完毕时苹果酒中总酯浓度为酵母属酵母发酵苹果酒的1.60倍,残余总糖低于4.0g/L。     

乳酸菌的抗氧化活性和耐酸耐胆盐性能的研究

以清除DPPH自由基和还原能力为指标,对实验室保藏的25株乳酸菌的菌体和无细胞提取物进行体外抗氧化性研究;将抗氧化性强的10株乳酸菌,进行对模拟胃液酸度和肠道胆盐的耐受性研究,比较不同乳酸菌株的抗氧化和耐酸耐胆盐能力,为开发功能性乳酸菌食品提供理论依据。研究表明:不同属和同属的不同菌株的乳酸菌抗氧化能力和耐酸耐胆盐存在差异,且其抗氧化活性物质存在部位不同。比较发现干酪乳杆菌GL-2抗氧化性高且耐酸耐胆盐。干酪乳杆菌GL-2菌体浓度为109cfu/mL时,菌体和无细胞提取物DPPH自由基清除率分别为37.22%、42.78%,还原活性分别相当于104.84、107.10μmol/L L-半胱氨酸;pH=3.0的酸性缓冲溶液处理2h后存活率均达100%,在改良MRS培养基(胆盐为0.5%(W/V))处理4h存活率为0.35%。