人血清淀粉样蛋白A1原核表达及胶体金检测方法的建立

通过胶体金免疫层析技术建立一种特异、便捷、快速的SAA1定量检测新方法.利用大肠杆菌BL21(DE3)原核表达人血清淀粉样蛋白A1(SAA1),根据BL21(DE3)表达偏好性设计并合成SAA1蛋白基因片段,构建表达载体pET-28a-SAA1,采用CaCl2法制备BL21(DE3)感受态,热激转化法将pET-28a-SAA1转入到BL21(DE3).经表达条件优化,获得重组蛋白最佳诱导表达条件:温度30℃,时间6h,转速180rpm/min,培养基pH 7.0,IPTG浓度0.4mM,诱导表达后目的蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定,Ni柱纯化、透析、浓缩从而获得浓度为8.09mg/ml,纯度为85%的SAA1.同时,结合胶体金标记技术,建立了SAA1胶体金免疫层析试纸检测方法,线性范围0.16~500μg/ml,最低检测限0.16μg/ml,该研究为临床体外诊断SAA1快速检测提供技术基础.     

醛酮还原酶AKR7A3原核表达条件的优化及酶学活性检测

AKR7A3属醛酮还原酶是NADPH依赖型的氧化还原酶超家族的一员,参与人体内很多极为重要的生理活动。本文构建原核表达载体,优化表达条件,获得可溶性好、活性高的AKR7A3属醛酮还原酶。研究了温度、转速、诱导时间和IPTG浓度等不同条件对AKR7A3酶表达量的影响,并进行了酶活性动力学检测分析。在16℃、110rpm/min、20h、1.00mM/L诱导剂浓度时AKR7A3可溶性蛋白达到99.0%。酶活性动力学检测结果说明在37℃;PH=7.0;NADPH浓度2mmol/L;底物浓度在2.00mmol/L;加酶量100μL时酶活性最好,最佳反应底物为睾丸酮。成功在大肠杆菌中表达出高活性的可溶性酶蛋白,并获得了体外酶活性的最佳动力学条件,为后续AKR7A3基础研究和应用研究提供实验基础。     

心肌损伤标志物肌酸激酶同工酶荧光检测方法的建立

肌酸激酶同工酶(Creatine kinase isoenzyme,CK-MB)是早期诊断急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)的重要标志物,该研究以荧光微球为标记物研究快速、灵敏的CK-MB荧光免疫层析检测方法。通过N-羟基琥珀酰(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)将荧光微球与市售的抗体共价偶联,优化抗体与荧光微球的偶联条件,对偶联获得的抗体荧光标记物进行表征,制备了CK-MB的荧光免疫层析检测卡,建立了CK-MB荧光免疫层析检测方法。荧光微球偶联率91.7%,CK-MB检测卡定量检测线性范围为1ng/ml~1000ng/ml,灵敏度达到了1ng/ml,CV值8%,回收率84%~108.3%。利用间接ELISA法对市售抗体进行筛选,获得了包被抗体以及标记抗体,建立了心肌损伤标志物肌酸激酶同工酶荧光检测方法,实现血清中CK-MB定性与定量检测,为心肌损伤标志物荧光免疫层析检测方法的研发提供了实验技术基础。     

BKR基因启动子鉴定及表达调控

BKR基因是睾丸酮丛毛单胞菌中的一个重要的甾体化合物降解酶基因,Tet R、LysR和LuxR蛋白是睾丸酮丛毛单胞菌中的调控蛋白。以EGFP为报告基因,构建p K-BKR-EGFP质粒,通过与p K-EGFP分别转化到大肠杆菌JM109,检测荧光信号,确定预测的序列中包含BKR基因的启动子。然后通过质粒共转化技术,检测Tet R、LysR和LuxR蛋白与p K-BKR-EGFP的荧光信号强度,探讨Tet R、LysR和LuxR三个蛋白与BKR基因之间的调控关系。实验结果表明:BKR基因的启动子在该基因前699bp内;LysR与BKR基因共转后荧光信号增强;Tet R和LuxR分别与BKR基因共转后荧光信号减弱。由此可以得出结论,LysR对BKR基因的调控起增强作用;Tet R和LuxR对BKR基因的调控起抑制作用。该实验揭示了睾丸酮丛毛单胞菌中BKR基因的调控序列,为CT菌利用甾体激素作为唯一的碳源及能源机理提供理论基础。