口蹄疫病毒WFL株2C-P3-3′NCR片段的克隆及适于设计siRNA的序列分析

目的筛选出口蹄疫病毒(FMDV)基因组上适于设计siRNA的基因片段。方法以FMDV WFL株RNA为模板,用3′RACE法扩增出2C-P3-3′NCR序列,将PCR扩增片段克隆到pMD18-T载体上,转化E.coli DH5α,筛选阳性重组子,进行序列测定,并与参考毒株序列比较。结果扩增的基因片段大小为4033bp,其2C、P3和3′NCR序列的核苷酸序列与参考毒株的同源性分别为87·11%～94·23%、84·91%～96·66%和66·98%～82·35%,2C和P3与参考毒株的氨基酸同源性分别为94·97%～99·39%和91·84%～98·55%,WFL株P3基因的第1150～1270、1680～1840和2080～2490bp以及2C基因的第354～470bp范围内与参考毒株具有高度保守的特性。因此,可以依据siRNA设计原则,在这4个区域内筛选抑制效果好的siRNA。结论成功克隆了FMDV WFL株2C-P3-3′NCR基因的序列,并筛选出4个适于设计siRNA的基因区段。     

传染性法氏囊病病毒疫苗B87株基因组B节段的克隆和序列分析

目的获得传染性法氏囊病病毒(IBDV)疫苗B87株B节段全长cDNA,并对其序列进行分析,为进一步在分子水平上研究病毒基因组的功能、抗原变异和毒力变异奠定基础。方法使用蛋白酶K和酚/氯仿抽提法提取病毒基因组RNA,用LiCl分级沉淀方法纯化病毒基因组dsRNA,通过RT-PCR一步扩增获得B节段的全长cDNA。将其克隆到pGEM-T载体上,然后测序,并用DNAStar软件进行序列分析。结果测序结果表明,克隆的B87株基因组B节段全长为2827bp,与超强毒参考株UK661和HK46的同源性分别为89.8%和89.3%,与强毒参考株Harbin-1和ZJ2000的同源性分别为90.2%和89.5%;与变异毒株GLS的同源性为97.8%;与弱毒参考株CEF94和Gt株的同源性均为99.8%,与P2株的同源性达100%。结论通过对9株IBDV编码氨基酸序列进行分析、比较,推测B节段上10个独特的氨基酸位点可能与毒力相关。     

口蹄疫病毒WFL株2C-P3-3''''NCR片段的克隆及适于设计siRNA的序列分析

目的 筛选出口蹄疫病毒(FMDV)基因组上适于设计siRNA的基因片段.方法 以FMDV WFL株RNA为模板,用3'RACE法扩增出2C-P3-3'NCR序列,将PCR扩增片段克隆到pMD18-T载体上,转化E.coli DH5α,筛选阳性重组子,进行序列测定,并与参考毒株序列比较.结果 扩增的基因片段大小为4 033 bp,其2C、P3和3'NCR序列的核苷酸序列与参考毒株的同源性分别为87.11%～94.23%、84.91%～96.66%和66.98%～82.35%,2C和P3与参考毒株的氨基酸同源性分别为94.97%～99.39%和91.84%～98.55%,WFL株P3基因的第1 150～1 270、1 680～1 840和2 080～2 490 bp以及2C基因的第354～470 bp范围内与参考毒株具有高度保守的特性.因此,可以依据siRNA设计原则,在这4个区域内筛选抑制效果好的siRNA.结论 成功克隆了FMDV WFL株2C-P3-3'NCR基因的序列,并筛选出4个适于设计siRNA的基因区段.     

传染性法氏囊病病毒疫苗株B87基因组A节段的克隆和序列分析

目的获得传染性法氏囊病病毒疫苗株B87 A节段全长cDNA,并对其进行序列分析。方法使用蛋白酶K、酚/氯仿抽提法提取病毒基因组,用LiCl分级沉淀方法纯化病毒基因组dsRNA,通过RT-PCR一步扩增获得A节段的全长cD-NA。将其克隆至pGEM-T载体上,测序,并用DNAStar软件进行序列分析。结果测序结果表明,克隆的B87株A节段全长为3 260 bp,与Gt株的同源性最高为99.5%,与其他毒株的核苷酸同源性介于95.2%~99.4%之间,与Ⅱ型毒株OH仅为84.0%。结论通过对20株IBDV编码氨基酸序列的分析、比较,推测A片段上7个独特的氨基酸位点可能与毒力相关。     

髓内钉与钢板治疗肱骨干骨折患者的疗效及安全性比较

目的:通过对新鲜肱骨干骨折患者分别采用顺行交锁髓内钉和锁定加压钢板治疗,比较两种方法的疗效及安全性.方法:42例新鲜肱骨干骨折患者随机分为髓内钉固定组和钢板固定组,分别采用两种方法治疗,术后随访时间10~25个月,平均13个月.随访期间失访患者7例,得到随访患者35例(髓内钉组21例,钢板组14例),比较两组患者的术后功能恢复情况、愈合时间及并发症发生率.结果:钢板固定组的优良率(92.8%)高于髓内钉固定组(71.5%)(P<0.05);髓内钉组延迟愈合(>16周)患者10例(47.6%),钢板组延迟愈合患者3例(21.4%),延迟愈合率组间差异有统计学意义(P<0.05).髓内钉组无桡神经损伤、无感染;钢板组桡神经一过性损伤1例(7.1%),发生感染1例(7.1%).结论:新鲜肱骨干骨折患者采用交锁髓内钉固定和钢板固定均可达到治疗目的,钢板固定后功能恢复优于髓内钉固定,钢板固定后延迟愈合患者比例低于髓内钉固定患者,临床可根据骨折的部位和类型选择内固定;在适应证相同的情况下,建议使用钢板内固定治疗新鲜肱骨干骨折.     

新城疫病毒TL1株F、HN蛋白基因共表达对细胞融合的影响

目的分析新城疫病毒TL1株F、HN蛋白基因共表达对细胞融合的影响。方法在6孔细胞培养板上将4种重组表达质粒以pCI-M+pCI-NP+pCI-F和pCI-M+pCI-NP+pCI-F+pCI-HN两种组合分别共转染BHK-21细胞,转染后48h,光镜观察细胞融合现象。在25cm2细胞培养瓶中,将4种重组表达质粒以上述两种组合分别共转染BHK-21细胞,转染后48h,收集细胞上清,离心后,电镜观察有无病毒样颗粒。结果以pCI-M+pCI-NP+pCI-F+pCI-HN组合共转染BHK-21细胞,可以观察到明显的细胞融合现象,而以pCI-M+pCI-NP+pCI-F组合共转染的BHK-21细胞则未出现细胞融合现象。两种组合共转染均形成了新城疫病毒样颗粒,包含HN蛋白基因的4种重组质粒组合共转染形成的病毒样粒子更接近于真实的新城疫病毒粒子。结论HN蛋白基因具有促进细胞融合的功能,新城疫病毒样颗粒的成功表达为新城疫病毒致病机理和新型疫苗的研究奠定了基础。     

口蹄疫病毒2B基因绿色荧光蛋白融合表达质粒的构建及表达

目的构建口蹄疫病毒(FMDV)2B基因绿色荧光蛋白(GFP)融合表达质粒,并在BHK-21细胞中表达。方法RT-PCR扩增O型口蹄疫病毒WFL株的2B基因,克隆入表达载体pEGFP-C1,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染BHK-21细胞,检测绿色荧光蛋白的表达和2B基因转录水平。结果经双酶切及PCR鉴定,目的基因片段大小与预期相符,测序结果与WFL株相应序列一致。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内绿色荧光蛋白的表达,荧光定量PCR检测到细胞内有2B基因的转录。结论已成功构建了FMDV2B基因GFP融合表达质粒,并在BHK-21细胞中获得了表达。     

羊布鲁菌双抗体夹心ELISA检测方法的建立及验证

目的建立羊布鲁菌双抗体夹心ELISA检测方法,并进行验证。方法应用针对羊布鲁菌O链M抗原的种特异性单克隆抗体,建立检测羊布鲁菌抗原的双抗体夹心ELISA方法,并进行重复性、特异性、敏感性验证及初步应用。结果经验证,该方法重复性好,特异性强,最低检出限为3.0×103CFU/ml,与平板凝集试验的符合率为100%。结论已建立了特异、敏感的检测羊布鲁菌的双抗体夹心ELISA方法。     

PEG/PVA相变复合纳米纤维的制备及其性能研究

在室温下制得了PEG/PVA相变复合纳米纤维。探讨了PVA/PEG和PEG2000/PEG4000各自不同质量分数、外加电压、接收距离、外加盐离子等参数对纤维直径和纤维网形态的影响。结果表明PEG/PVA为60/40,电压为15kV,接受距离为10cm时,成纤较好。运用DSC测试复合纳米纤维的可逆相转变特性,Tm和TC值与PEG2000/PEG4000的比例有关。     

新城疫病毒TL1株L基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的对新城疫病毒TL1株L基因进行克隆、序列分析及真核表达载体构建。方法根据GenBank登录的新城疫病毒L基因序列,设计了一对引物,用RT-PCR对内蒙古分离株TL1的L基因进行整体扩增。将扩增产物提纯后,克隆入pGEM-Teasy载体,再亚克隆至真核表达载体pCI-neo上,通过酶切、PCR鉴定及测序进行验证。结果测序拼接得出L基因的全序列长度为6704bp,该基因的ORF总长为6615bp,编码2204个氨基酸。与GenBank登陆的12株参考毒株比较L基因编码区全核苷酸序列和氨基酸序列,发现TL1株与鹅源新城疫NA-1株、ZJ1株和SF02株的同源性极高,说明四者亲缘关系较近。结论已成功构建L基因真核表达载体,为对该株病毒进行反向遗传操作以及有关功能基因组研究奠定了基础。