大肠杆菌色氨酸操纵子基因突变株的构建与表达

目的构建大肠杆菌色氨酸操纵子基因突变株,提高邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的产量。方法利用依赖于DpnⅠ酶的PCR方法突变表达载体pET-22b(+)-Trp Operon上的关键位点,PCR扩增Trp OperonM基因,构建pET-22b(+)-Trp OperonM重组表达质粒,经酶切及测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。制备粗酶液,经比色法测定邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性。结果 PCR扩增产物可见约7000bp的Trp OperonM条带;所构建的重组表达质粒经酶切及测序鉴定正确;邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性比大肠杆菌BL21(DE3)空菌分别提高了4.5倍和5.2倍。结论已成功构建了大肠杆菌色氨酸操纵子基因突变株BL21(DE3)/pET-22b(+)-Trp OperonM,邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性均有提高,为高产色氨酸基因工程菌的构建奠定了基础。     

高活力液体碱性蛋白酶制备工艺研究

为了获得高质量浓缩液体蛋白酶,对提取工艺中不同絮凝剂,不同大小活性炭以及膜过滤条件进行了优化.结果表明0.1%质量分数NaAlO2絮凝剂在pH=8.0时絮凝速度快、效果好;1%中型颗粒活性炭脱色效果明显;聚丙烯膜超滤温度10℃、压力0.05 MPa时酶的回收率最高.优化后的工艺使液体酶活力提高到3.2×105 μ/mL,使初始发酵液浓缩了8.3倍,酶回收率达到83.6%.