人蛋白C转基因小鼠的建立及乳腺表达

目的为了获得乳腺定位表达人蛋白C(hPC)的转基因动物。方法采用分步克隆的方法,构建大鼠乳清酸蛋白(WAP)启动子调控的人蛋白C质粒,命名为pWPC。将该质粒系统鉴定后,用PvuⅠ+SmaⅠ双酶切,回收4·6kb的片段(WAP-hPC-PolyA)。通过显微注射技术,将其注入昆明小鼠受精卵雄原核内;共注受精卵810枚,存活640枚,移植给28只假孕母鼠,怀孕的18只母鼠共产仔81只。结果提取鼠尾基因组DNA进行PCR检测,34只阳性,再经Southernblot检测,其中20只整合阳性;将7只整合阳性母鼠传代,产仔7日后收集乳汁,进行ELISA检测,结果均有表达。结论已成功建立了人蛋白C转基因鼠乳腺生物反应器,为hPC乳腺表达研究奠定了基础。     

人乙酰胆碱酯酶(AchE)cDNA克隆及真核表达载体的构建

目的　克隆人乙酰胆碱酯酶 (AchE)cDNA并构建真核表达载体。方法　根据GeneBank中hAchE核苷酸序列 ,设计并合成 1对特异性扩增hAchE的引物 ,从 18周龄引产的胎儿大脑组织中提取RNA为模板 ,利用RT PCR技术扩增出hAchEcDNA片段 ,并与pGEM T载体连接 ,转化大肠杆菌DH5α中 ,经IPTG X gal诱导培养 ,筛选白斑提取重组载体 ,经酶切和PCR鉴定及序列测定与分析 ,并构建hAchE真核表达载体pcDNA3 .1(+) hAchE。结果　已克隆的hAchEcDNA片段全长约 1.9kb ,其测序结果与基因文库中的人乙酰胆碱酯酶cDNA序列相符。结论　在国内首次利用RT PCR成功地克隆了hAchEcDNA全长 ,并构建了hAchE真核表达载体pcDNA3 .1(+) hAchE ,为进行hAchE的结构与相关功能研究和基因工程生产奠定了基础。     

~3H-NSP的合成及对生物大分子的标记

在蛋白质及多肽等生物大分子研究中,往往需要用放射性同位素进行标记以达到追踪或检测的目的。1981年Dolly等报道用N-琥珀酰亚胺[2,3-~3H]丙酸-酯(~3H-NSP)标记银环蛇毒素成功,1983年Yuis等发表了合成~3H-NSP的方法。我们参考此法,改进了反应溶剂和纯化方法,合成了~3H-NSP,总产率17.3％,比度525.4GBq/mmol,放化纯>98％,随后又将丙烯酸与N-羟基琥珀酰亚胺先缩合成琥珀酰亚胺丙烯酸酯,再氚化制备~3N-NSP,获得成功,产率80％,比度1.33TBq/mmol,放化纯>95％,从而使引入标记元素改在最后一步,缩小了合成量,节省了氚气,并提高了产率。用我们合成的~3H-NSP分别标记了丙种球蛋白、乙酰胆碱酯酶、过氧化氢酶和眼镜蛇毒素都获成功,并保持生物活性。