ChBD和SUMO双功能融合肝素酶I的设计与表达

利用ChBD和SUMO标签构建4种不同的融合蛋白体系,分别为ChBD-Hep I、ChBD-SUMO-Hep I、SUMO-ChBD-Hep I和ChBD-Hep I-SUMO。经过发酵工艺优化实验,确定该4种酶在最优条件下的摇瓶发酵酶活分别为2.44IU/mL、6.92IU/mL、6.01IU/mL和4.51 IU/mL。同时,通过酶学性质研究,确定该4种重组酶的最适反应温度与pH分别为30℃和7.0,表明SUMO和ChBD标签不影响Hep I的催化反应。4种重组酶的热稳定性较天然Hep I明显提高,其中ChBD-SUMO-Hep I在30℃半衰期达50 min,由此,确定其为最优菌株。将ChBD-SUMO-Hep I进行5 L发酵罐扩大培养,酶活达到26 IU/mL,是摇瓶培养的5倍,表明其具有工业化生产的潜质。     

Ni2+螯合的琼脂糖凝胶载体用于重组酶SUMO-Hep I-His的固定化

以Ni~(2+)螯合的琼脂糖凝胶(GLK-Gel Ni)作为固定化载体,对融合肝素酶Sumo-Hep I-His的固定化进行了研究,实现了融合酶的一步纯化和固定化。通过对固定化条件的优化,得到较优的固定化体系:载体与粗酶质量比为30∶1,固定化pH为7.0,吸附时间为6 h,该条件下获得的固定化酶酶活10.07±0.35 IU/mL载体。酶学性质研究结果表明:固定化酶在30℃的热稳定性相对于游离酶显著提高,固定化酶半衰期是游离酶的8倍,最适反应温度提高了3℃,反应pH的耐受性也有了明显的提高。此外,与游离酶相比,固定化酶的储藏稳定性和可重复利用性良好,在4℃下放置60 d能保持76%的初始活性;固定化酶重复使用8次后,酶活仍剩余75.8%;而且GLK-Gel Ni载体本身具有良好的重复利用性,重复固定5次Sumo-Hep I-His后,载体对酶的活性吸附仍能达到88.9%。整体而言,固定化Sumo-Hep I-His显现了较好的工业应用潜能。