高效表达干扰素α1b(IFN-α1b)工程菌的高密度发酵及干扰素纯化

目的 在构建高效表达IFN-α1b重组大肠杆菌工程菌的基础上,建立适合该工程菌的发酵和纯化工艺。方法 采用高密度培养方法(HCDC)和柱层析纯化技术。结果 发酵密度A_(600)可达70,表达量为菌体总蛋白的30％左右。经破菌、离心、离子交换和分子筛凝胶过滤得到IFN-α1b纯品,FPLC测定纯度为100％,活性为4.99×10~7 U/ml,比活为2.5×10~7 U/mg,均符合2000版《中国生物制品规程》要求。结论 已建立了适用于规模化生产的发酵纯化工艺。     

采用可溶性噻唑盐WST-8检测细胞病变

目的　建立一种简便和客观的检测细胞病变的方法。方法　活细胞代谢过程中 ,可溶性噻唑盐WST 8在电子载体 1 MethoxyPMS存在时被还原形成的可溶性甲染料 ,通过读取A4 50 6 30 间接检测活细胞的个数 ,可用于细胞病变的检测。将WST 8法用于rhIFN α1b效价的检测 ,并与结晶紫法和常规镜检相比较。结果　相关性研究表明在一定细胞浓度范围内 (2 0 0～ 5 5 0 0 0细胞 孔 )Wish活细胞个数与A4 50 6 30 值呈线性相关 ,相关系数为 0 998。WST 8法检测rhIFN α1b的效价结果与结晶紫法和常规镜检结果基本一致 ,相关系数分别为 0 911(P <0 0 0 1)和0 94 5 (P <0 0 1)。结论　WST 8法适用于以微量细胞病变法为基础的溶细胞型病毒滴度检测及抗肿瘤或抗病毒药物效果的检测     

聚乙二醇修饰重组人干扰素-α1b条件的优化

目的对聚乙二醇(PEG)衍生物化学修饰重组人干扰素-α1b(rhIFN-α1b)的条件进行优化。方法以3种不同的第2代PEG衍生物对rhIFN-α1b进行修饰,SDS-PAGE分析PEG及修饰产物的表观相对分子质量。对反应pH值、温度、时间、修饰剂用量等修饰条件进行优化,并对修饰产物进行初步分离纯化和活性检测。结果PEG的电泳表观相对分子质量大于其理论值;PEG20000的修饰率(92.1%)高于PEG5000和PEG10000;修饰剂用量和pH值是主要影响因素,最佳pH为9.0,rhIFN-αlb与PEG20000的最佳摩尔比为1∶10,时间和温度影响甚微。单点修饰产物保留了14.4%的体外活性,多点修饰产物无活性。结论选择了合适的PEG衍生物并优化了修饰条件,为进一步深入研究奠定了基础。     

乙型脑炎病毒SA_(14)-14-2减毒疫苗株的生物学和基因稳定性

目的研究乙型脑炎病毒(JEV)SA14-14-2减毒疫苗株传代过程中的生物学和基因稳定性,为疫苗的安全性和免疫原性提供依据。方法将JEVSA14-14-2减毒疫苗株PHKC7代病毒在原代地鼠肾细胞(PHKC)上连续传代,检测各代次病毒的培养特性以及第8、12、17和22代病毒的安全性及免疫原性;对起止代次病毒(PHKC8和22代)进行全基因组序列测定,对中间代次病毒(PHKC12和17代)的结构蛋白基因进行测序,并与基因库乙脑病毒SA14-14-2株(D90195)比较。结果各代次病毒产生的细胞病变基本一致,病毒滴度在17代前较稳定;在BHK21细胞上形成的蚀斑形态一致;小鼠脑内的致病力未发生变化,乳鼠传代返祖试验高代次病毒毒力有升高趋势。8、12、17和22代病毒免疫小鼠后,对P3强毒攻击均具有保护作用。E蛋白核苷酸和氨基酸序列,PHKC8代与D90195完全一致;而PHKC12、17和22代出现单个碱基(第2142或2143位)突变,导致E389氨基酸改变(D→N或D→A),但并非回复突变。4个代次病毒的PrM-C区结构蛋白基因均未发生变化。PHKC8、22代病毒的其他核苷酸突变发生在基因组非结构蛋白区和3′端非编码区;全序列PHKC8和22代与D90195比较,发现7～8个核苷酸不同,导致3～4个氨基酸的差异,核苷酸和氨基酸的同源性分别大于99.93%和99.88%,且以上突变不存在于明确的相关减毒位点上。结论JEVSA14-14-2减毒疫苗株在PHKC上连续传15代,仍保持高度的生物学和基因稳定性,疫苗生产用病毒控制在10代以内较为安全。     

百日咳毒素S1亚单位截短片段的表达、纯化及初步应用

目的表达并纯化百日咳毒素(PT)S1亚单位截短片段S146,以其制备抗体,初步建立检测PT的双抗体夹心ELISA法。方法PCR扩增S146基因,亚克隆至载体pUC18,鉴定正确后,插入表达载体pET16b,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,用镍离子亲和层析柱纯化,复性后的蛋白免疫家兔,制备抗血清,纯化后作为包被抗体,建立检测PT的双抗体夹心ELISA法,并检测其特异性。结果表达的重组蛋白相对分子质量约为19000,主要存在于破菌沉淀中,表达量占菌体总蛋白的44%;纯化后蛋白纯度为94.5%;家兔抗血清可特异性识别天然PTSI;建立的双抗体夹心ELISA法特异性良好。结论已成功表达、纯化了PTS1亚单位截短片段S146,并以纯化的抗S146抗体作为包被抗体,初步建立了检测PT的双抗体夹心ELISA法,为研制特异性检测试剂和提供一种疫苗的质量控制方法奠定了基础。     

TRAIL_(114～281)-IL-24融合蛋白的原核表达及其体外抗肿瘤细胞活性

目的原核表达肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)114～281肽和人白细胞介素-24(Interleukin-24,IL-24)融合蛋白,并检测其体外抗肿瘤细胞活性。方法以人外周血单个核细胞总RNA为模板,PCR扩增TRAIL114～281和IL-24基因,经T4DNA连接酶连接成融合基因,克隆至pET-28a载体中,构建重组原核表达质粒pET-28a/TRAIL114～281-IL-24,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白TI经层析法纯化后,进行Western blot分析,并采用MTT法检测其对肿瘤细胞增殖的影响,caspase3活性检测试剂盒检测其对不同肿瘤细胞caspase3活性的影响。结果重组表达质粒经酶切鉴定及测序证明构建正确;TI融合蛋白以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的30%;纯化的重组蛋白纯度可达95%,且可与鼠抗人IL-24抗体发生特异性反应;经复性的蛋白能明显抑制人宫颈癌上皮细胞HeLa和人乳腺癌细胞MCF-7增殖,并显著提高肿瘤细胞的caspase3活性。结论已在大肠杆菌中表达了TRAIL114～281-IL-24融合蛋白,其具有诱导部分肿瘤细胞凋亡的活性。     

金黄色葡萄球菌α-溶血素及其突变体的原核表达和免疫学活性

目的原核表达金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)α-溶血素(α-hemolysin,Hla)及其突变体,并检测其免疫学活性。方法采用PCR法从S.aureus中扩增hla基因,将该基因克隆至原核表达载体p ET28a中,构建重组表达质粒p ET28a-hla,并利用点突变试剂盒进行突变,获得重组质粒p ET28a-hlaH35L。将两种重组表达质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;表达的重组蛋白经Ni-NTA亲和层析和CM离子交换层析纯化后,检测其溶血活性、免疫血清的抑制溶血活性及HlaH35L蛋白的免疫保护作用。结果重组表达质粒p ET28a-hla经双酶切和测序证明构建正确;重组质粒p ET28a-hlaH35L的测序结果显示,第35位氨基酸突变位点与设计相符。表达的Hla和HlaH35L蛋白相对分子质量约为36 000,均为可溶性表达,表达量约占菌体总蛋白的50%,纯化后纯度均在90%以上。Hla具有溶血活性,溶血比活为152 HU/mg;HlaH35L无溶血活性;抗Hla和抗HlaH35L血清均具有抑制Hla溶血的活性;在小鼠滴鼻攻击模型中,HlaH35L具有一定的保护作用。结论成功在大肠埃希菌中表达了具有良好免疫学活性的Hla及其突变体HlaH35L,为筛选S.aureus候选疫苗组分奠定了实验基础。