狂犬病病毒糖蛋白基因重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因重组慢病毒表达载体,并进行鉴定。方法将狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因克隆至慢病毒载体pLVX-ZsGreen-IRES上,筛选阳性重组克隆。将质粒pLVX-ZsGreen-IRES-SRV9G、包膜质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2共转染293T包装细胞系,通过荧光显微镜观察报告基因表达情况。收集上清,经浓缩后接种293T细胞,进行重组慢病毒感染细胞的鉴定;用限制性内切酶切除质粒pLVX-ZsGreen-IRES-SRV9G绿色荧光蛋白基因,采用直接免疫荧光试验检测狂犬病病毒糖蛋白的表达情况。结果重组慢病毒表达载体经酶切和测序证明构建正确。荧光显微镜下可见重组慢病毒感染的293T细胞有大量绿色荧光出现,病毒滴度为3×107 IU/ml;直接免疫荧光检测表明,糖蛋白基因在293T细胞内获得有效表达。结论成功构建了狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因重组慢病毒载体,为狂犬病基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

鼬獾狂犬病病毒分离株的培养及其免疫原性

目的对分离的鼬獾狂犬病病毒BHK-21细胞适应株进行毒力和免疫原性检测,为兽用狂犬病疫苗的生产奠定基础。方法将分离获得的鼬獾狂犬病病毒野毒株JX08-45在BHK-21细胞上连续传代,采用直接免疫荧光法测定病毒滴度(TCID50);PCR法检测外源病毒和支原体。以β-丙内酯灭活病毒液,将灭活的病毒液免疫犬,采用FAVN法检测狂犬病病毒中和抗体水平,分析其免疫原性。结果鼬獾狂犬病病毒野毒株JX08-45在体外培养至130代时,病毒滴度可达1.0×107.75 TCID50/ml;未从狂犬病病毒JX08-45株中扩增出犬瘟热病毒、细小病毒、冠状病毒、腺病毒和支原体的特异性核酸;灭活的病毒液接种犬后产生的中和抗体可持续1年以上,且均在0.5 IU/ml以上。结论鼬獾狂犬病病毒野毒株JX08-45经BHK-21细胞传代适应性较好,病毒滴度较高,且具有较好的免疫原性,已具备制备疫苗的基本条件。     

我国狂犬病流行毒株JX08-45适应细胞培养后的生物学特性

目的鉴定我国狂犬病流行毒株JX08-45适应细胞培养后(命名为JX08-45CC株)的生物学特性。方法通过全基因组序列分析比对、小鼠脑内和外周攻毒试验和免疫原性试验,分别对JX08-45CC株的基因组特点、毒力和免疫原性进行鉴定。结果 JX08-45CC株的基因组序列与JX08-45株比对,共出现16个核苷酸突变点和7个氨基酸突变点,其中6个氨基酸变异发生在G蛋白(333位精氨酸未改变)编码区,L蛋白仅有1个氨基酸突变;在G蛋白氨基酸变异中,4个突变序列在其他细胞适应毒株CVS-11、CTN-1、Nishigahara、SAG2、Flury-LEP和SRV9中也普遍存在。JX08-45CC株培养滴度≥107TCID50/ml时,脑内接种小鼠的致死率为100%,滴度为102～106TCID50/ml时,脑内接种小鼠的致死率为20%～80%;滴度为105～108TCID50/ml时,外周肌肉接种小鼠,致死率为10%～70%;脑内和外周攻毒小鼠的潜伏期均为7～9 d,并于发病后24～48 h死亡。JX08-45CC株与狂犬病病毒CVS-11、ERA、SRV9和Flury-LEP株的中和抗体滴度差异均无统计学意义(P>0.05)。结论已对JX08-45CC株的基因组序列、毒力和免疫原性等生物学特性进行了鉴定,为开发具有我国自主知识产权的兽用狂犬病灭活疫苗候选株奠定了基础。