重组杆状病毒高效表达猪圆环病毒2型Cap蛋白及其免疫特性分析

目的利用重组杆状病毒高效表达猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)Cap蛋白,并分析该蛋白的免疫特性。方法将PCV2 Cap基因克隆至转移载体pFastBacⅠ,转化感受态E.coli DH10Bac细胞,获得重组杆粒r Bacmid-Cap,转染Sf9细胞,SDS-PAGE和Western blot法检测重组杆状病毒,并于High Five(H5)细胞中进行高效表达。将小鼠随机分为PBS对照组、杆状病毒组、重组杆状病毒组及疫苗对照组,均经小鼠肌内注射,100μL/只,分别于第0和14天进行免疫,于首免后第21、28、35及42天经小鼠眼眶静脉丛采血,分离血清,ELISA法进行检测。结果 PCR和测序分析结果表明,重组转移质粒和重组杆粒构建正确。重组PCV2 Cap蛋白的相对分子质量约28 000,可与抗His标签单克隆抗体及抗PCV2 Cap多克隆抗体发生特异性结合。重组杆状病毒按MOI=5及1感染H5细胞约72 h,PCV2 Cap蛋白表达量最高,表达产量约150μg/mL。首免后第21、28、35及42天,重组杆状病毒组小鼠血清抗体水平明显高于PBS对照组及杆状病毒组(P 0. 001);首免后第21、28、35天,重组杆状病毒组小鼠血清抗体水平明显高于疫苗对照组(P 0. 05),首免后第42天,两组差异无统计学意义(P 0. 05)。结论成功利用杆状病毒表达系统高效表达了PCV2 Cap,重组蛋白可诱导小鼠产生较高水平抗体,本研究为PCV疫苗的研制奠定了基础。     

汉坦病毒SEO型S基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

目的构建汉坦病毒SEO型S基因原核表达载体。方法应用RT-PCR方法扩增汉坦病毒SEO型的YZG-Changchun株S基因,克隆至pMD18-T载体中,经酶切鉴定及PCR分析后,定向克隆入原核表达载体pET-28a中,转化E.coliRosetta,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析外源蛋白的表达情况。结果表达载体经双酶切和测序证明构建正确。IPTG浓度为1.0 mmol/L,诱导4.5 h时,S基因在原核细胞中得到了高效表达,表达的蛋白占菌体蛋白总量的37%,纯化后的蛋白具有良好的抗原活性。结论已成功构建了汉坦病毒SEO型S基因原核表达载体,并得到高效表达。     

人а干扰素转基因小鼠模型的建立

[目的]建立人а干扰素(interferon-а,IFN-а)转基因小鼠,为研究IFN-а在抗病毒中的作用提供模型动物.[方法]将人IFN-а基因插入CMV启动子下游,构建转基因表达载体,通过原核显微注射法建立IFN-а转基因小鼠.[结果]通过特异性引物PCR法和South-ern杂交法检测出4只阳性转基因小鼠.分离4个转基因鼠系F<,1>代PCR阳性小鼠血液中的淋巴细胞进行RT-PCR检测,其中3个鼠系为阳性.收集阳性小鼠血清,用ELISA方法和微量板染色测定法检测出3个转基因鼠系均有IFN-а表达.[结论]成功建立了CMV启动子启动的表达人IFN-а基因转基因小鼠,为研究干扰素抗病毒机制及对其他动物进行抗病毒感染基因工程育种研究奠定了基础.     

狂犬病病毒糖蛋白基因重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因重组慢病毒表达载体,并进行鉴定。方法将狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因克隆至慢病毒载体pLVX-ZsGreen-IRES上,筛选阳性重组克隆。将质粒pLVX-ZsGreen-IRES-SRV9G、包膜质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2共转染293T包装细胞系,通过荧光显微镜观察报告基因表达情况。收集上清,经浓缩后接种293T细胞,进行重组慢病毒感染细胞的鉴定;用限制性内切酶切除质粒pLVX-ZsGreen-IRES-SRV9G绿色荧光蛋白基因,采用直接免疫荧光试验检测狂犬病病毒糖蛋白的表达情况。结果重组慢病毒表达载体经酶切和测序证明构建正确。荧光显微镜下可见重组慢病毒感染的293T细胞有大量绿色荧光出现,病毒滴度为3×107 IU/ml;直接免疫荧光检测表明,糖蛋白基因在293T细胞内获得有效表达。结论成功构建了狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因重组慢病毒载体,为狂犬病基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

犬细小病毒VP2蛋白重组人5型腺病毒的构建

目的构建犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)VP2蛋白重组人5型腺病毒。方法将从CPV中PCR扩增的VP2基因克隆至穿梭质粒pacAd5 CMVK-NpA中,经酶切及测序鉴定,将构建正确的重组穿梭质粒pacAd5-cVP2与骨架质粒pacAd5 9.2-100经PacⅠ酶切线性化,共转染293AD细胞,进行同源重组,包装出重组腺病毒rAd5v-cVP2,按Karber法计算重组腺病毒的病毒滴度(TCID50)。电镜下观察重组腺病毒的形态;RT-PCR及Western blot法检测CPV VP2基因mRNA的转录及蛋白的表达水平。结果重组穿梭质粒pacAd5-cVP2经酶切及测序证明构建正确;包装出的重组腺病毒rAd5v-cVP2的病毒滴度可稳定在108.25TCID50/ml;电镜下观察可见典型的腺病毒外型特征;重组腺病毒感染的293AD细胞可检测到VP2基因的转录和表达。结论已成功构建了CPV VP2蛋白重组人5型腺病毒。     

狂犬病毒糖蛋白基因-腺病毒E3区缺失转移表达载体的构建及表达

目的构建狂犬病毒糖蛋白基因-腺病毒E3缺失转移表达载体,并在MDCK细胞系统中高效表达。方法将含狂犬病毒SRV9株糖蛋白(Rgp)cDNA的pGT载体,经双酶切后回收Rgp基因片段,与经双酶切的真核表达载体pIRES1neo连接,得到pIRES1Rgp,再经双酶切后回收2623bp片段,与E3缺失载体pBE3L连接,得到含狂犬病毒糖蛋白基因-腺病毒E3缺失转移表达载体pBE3LCRgp,再转染MDCK细胞。结果pBE3LCRgp转染的MDCK细胞,经间接ELISA和间接免疫荧光法在其培养上清中均能检出Rgp的高效表达。结论已成功构建狂犬病毒糖蛋白基因-腺病毒E3缺失转移表达载体,并在MDCK细胞中高效表达。     

蚓激酶在牛乳腺中的稳定表达

目的构建蚓激酶重组逆转录病毒载体,并在牛乳腺中稳定表达蚓激酶。方法将含有蚓激酶基因的表达盒插入到逆转录病毒载体pLNCL中,获得蚓激酶重组逆转录病毒载体,利用脂质体转染PA317包装细胞,G418筛选阳性细胞克隆,克隆扩大培养后,病毒上清转染妊娠7个月奶牛乳腺小叶组织。产犊后采奶样,FAPA法检测蚓激酶活性,并进行凝胶薄层扫描分析。结果蚓激酶重组逆转录病毒最高滴度约为1×104CFU/ml。奶牛产后奶样中蚓激酶基因在牛乳腺中可连续表达112d,活性相当于30000英国单位/L牛奶,在牛奶中表达量可达180mg/L牛奶。结论已成功构建蚓激酶重组逆转录病毒载体,蚓激酶可在牛乳腺中相对稳定地表达。     

治疗性狂犬病病毒单克隆抗体的研究进展

狂犬病是一种重要的人兽共患传染病,每年全世界约有上百万人暴露于该病。狂犬病严重暴露者应在接种狂犬病疫苗进行主动免疫的同时,接种马抗狂犬病病毒免疫球蛋白(ERIG)或人抗狂犬病病毒免疫球蛋白(HRIG)进行被动免疫。然而,应用ERIG或HRIG存在引起过敏反应或传播血液性疾病的危险,应用治疗性单克隆抗体可以克服上述缺点。本文就鼠源性狂犬病病毒单克隆抗体和人源化狂犬病病毒单克隆抗体的研究进展、作用机制及大规模研制等作一综述。     

基于Xcm I酶切的pUC19-T载体的构建

[目的]构建以pUC19质粒为基础可利用Xcm I内切酶制备的T载体.[方法]化学合成2条含有双Xcm I酶切位点的互补寡聚核苷酸链,经过变性、复性后克隆入PUC19质粒的Hind Ⅲ和BamH I位点之间,通过Xcm I酶切后得到一个线性化的带有3'末端突出一个T碱基的T载体.[结果]经TA克隆验证,制备的pUC19-HB-T载体对PCR产物的克隆率达到95%以上.[结论]构建的pUC19-HB-T载体可用于PCR产物的克隆、测序及后续分子生物学操作.     

几种理化因子对狂犬病病毒分离株感染力影响的再检测

目的 分析几种理化因子对狂犬病病毒街毒分离株感染力的影响。方法将2006年分离的1株狂犬病街毒BD06株适应细胞后的第18代毒株暴露于不同的理化条件下,通过接种BHK-21细胞测定其病毒滴度(TCID50),观察其感染力的变化。结果 BD06株狂犬病病毒在100℃作用10 s和56℃作用2 min可以完全灭活,在37℃可存活6 d,4℃可存活2周,-20℃以下可存活半年以上;病毒置紫外线灯下30 cm处2 min内全部被灭活;在pH 6～10的中性环境下能够存活,在pH 5以下的弱酸性和pH 11以上的碱性环境中,10 min内可完全灭活;病毒对胰酶稳定;30%以上的丙酮在20 min,2倍体积的氯仿在5 min,75%的乙醇在2 min,0.05%的甲醛在6 h,10%的甲醛在5 min内均可将病毒全部灭活。结论分析了几种理化因子对狂犬病病毒BD06株感染力的影响,为生产实践中灭活狂犬病病毒或消毒提供了参考。