Ⅱ型登革病毒前膜抗体对该病毒在THP-1细胞中复制能力的影响

目的探讨Ⅱ型登革病毒(dengue virusⅡ,DENVⅡ)前膜(presynaptic membrane,prM)抗体对DENVⅡ在THP-1细胞中复制能力的影响。方法采用不同稀释度(1/4~1/16 384)的DENVⅡanti-pr M单克隆抗体分别与不同MOI的DENVⅡ(MOI分别为3、0.75及0.19)复合感染THP-1细胞。建立DENVⅡ荧光定量PCR检测标准曲线,检测THP-1细胞培养上清液的病毒拷贝数。结果 DENVⅡ按MOI=3感染THP-1细胞,当prM稀释度为1/16和1/16 384时诱发THP-1细胞产生病毒的载量较高,prM稀释度为1/64和1/256时抑制病毒生长;DENVⅡ按MOI=0.75感染THP-1细胞,当prM稀释度1/16时可诱发更高浓度病毒载量;DENVⅡ按MOI=0.19感染THP-1细胞时,不会诱导产生高浓度的病毒载量。结论中浓度pr M抗体可抑制DENVⅡ在THP-1细胞中的复制能力,而高及低浓度prM抗体可促进DENVⅡ在THP-1细胞中的复制能力。     

二磷酸氯喹对THP-1细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨不同浓度二磷酸氯喹对急性单核细胞性白血病细胞THP-1增殖及凋亡的影响。方法分别用10、20、40、80、100μmol/L氯喹处理THP-1细胞,分别于处理12、24、48和72 h收集细胞,MTS法检测细胞增殖情况,同时采用Hoechst33342荧光染色法及流式细胞仪检测二磷酸氯喹对THP-1细胞凋亡的影响。结果处理细胞12、24 h时,10、20、40、80、100μmol/L二磷酸氯喹对细胞增殖无明显影响,各组间差异无统计学意义(P0.05);处理细胞48、72 h时,各浓度二磷酸氯喹对细胞增殖均有抑制作用,细胞活力均明显下降,各组间差异有统计学意义(P0.01),并具有剂量依赖性。不同浓度二磷酸氯喹对THP-1细胞凋亡均具有诱导作用,且随着浓度的增加,细胞凋亡愈加明显。结论二磷酸氯喹在体外可抑制THP-1细胞的增殖,并诱导细胞凋亡,其作用具有剂量依赖性。     

登革病毒Ⅰ型拷贝数标准质粒和检测体系的建立及其应用

目的建立登革病毒Ⅰ型(dengue virus-Ⅰ,DENV-Ⅰ)拷贝数标准质粒及其检测体系。方法将DENV-Ⅰ的前膜蛋白基因克隆至pMD19-T载体,建立DENV-Ⅰ标准质粒,采用实时荧光定量PCR法进行扩增,获得Ct值与病毒拷贝数的关系,绘制标准曲线,得到相应的标准曲线方程。采用建立的标准质粒及检测体系对3份2017年云南西双版纳DENV-Ⅰ患者的血清进行检测。结果经双酶切及测序鉴定,DENV-Ⅰ拷贝数标准质粒构建正确。实时荧光定量PCR得到的标准曲线方程为y=-0. 300 5 x+12. 133,R~2=0. 991 9。3份血清样品原液的病毒拷贝数分别为9 417 703. 12、21 949 591. 01及19 027 096. 91 copies/μL。结论成功建立了DENV-Ⅰ拷贝数标准质粒及其检测体系,且准确性较好,灵敏度较高,可用于血清样品中DENV-Ⅰ拷贝数的检测。     

登革病毒1型Ⅰ～Ⅴ基因亚型的基因组差异分析

目的分析登革病毒1型(Dengue virus type 1,DENV-1)Ⅰ～Ⅴ基因亚型基因组全长核苷酸及氨基酸序列差异。方法通过GenBank搜索DENV-1 5个不同基因亚型的全长基因组序列,获得其相应的氨基酸序列。采用BIOEDIT软件,统计基因亚型间核苷酸突变和氨基酸替代位点,分析其相似度,通过RNA二级结构在线预测网站预测DENV-1不同亚型间3′UTR的二级结构差异,蛋白结构在线预测网站预测主要流行于中国的Ⅰ及ⅤDENV-1基因亚型结构蛋白的二级结构,对其氨基酸组成及编码序列中可能存在的蛋白结合区域等进行差异分析。结果DENV-1 5个基因亚型核苷酸相似性为91. 40%～94. 50%,氨基酸序列相似性为97. 11%～98. 38%,5个基因亚型各自编码3 392个氨基酸,其中共有195个位点有氨基酸的变化。DENV-1不同亚型的3′UTR的二级结构各不相同。DENV-1基因型为Ⅰ、Ⅴ的775个氨基酸中占组成比例最多的均是苏氨酸(T),Ⅰ型可能的蛋白结合位点有26个,多聚核苷酸结合位点有9个。Ⅴ型可能的蛋白结合位点有24个,多聚核苷酸结合位点有7个。他们均有相同数量的螺旋和跨膜螺旋。结论通过对DENV-1 5个不同的基因亚型的全长核苷酸和氨基酸序列的比较分析,及Ⅰ、Ⅴ基因亚型结构蛋白二级结构的预测,为研究DENV-1不同基因型之间的生物学和致病性差异提供参考。