慢性粒细胞白血病Bcr/Abl基因OD域融合蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化慢性粒细胞白血病(CML)Bcr/Abl基因OD域融合蛋白。方法将TAT、OD和HA基因片段顺次克隆入pET32a(+)原核表达载体,构建重组原核表达质粒pTAT-OD-HA,经PCR、双酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coliBL2(lDE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Westernblot分析后,用镍离子亲和层析柱纯化。结果所构建的重组质粒pTAT-OD-HA经PCR、双酶切及测序鉴定正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为30000,诱导6h蛋白表达量达最高,约为10%;Westernblot分析显示,该蛋白可与鼠抗HA单克隆抗体发生特异性反应;纯化后纯度约为95%。结论已成功原核表达并纯化了TAT-OD-HA融合蛋白,为进一步研究其在CML中的作用奠定了基础。     

CTP-OD-HA融合蛋白的原核表达及其活性鉴定

目的构建CTP-OD-HA融合基因原核表达质粒,表达并纯化融合蛋白,并检测其在人慢性粒细胞白血病(CML)K562细胞株中的转导活性及胞浆定位。方法分别将胞浆转导肽(CTP)、寡聚化区域(OD)基因和流感病毒血凝素抗原表位(HA)片段依次连接入pET32a(+)质粒,构建重组原核表达质粒pCTP-OD-HA,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经亲和纯化、Western blot验证、肠激酶切割、目的蛋白回收和FITC标记后,将FITC-CTP-OD-HA融合蛋白作用于K562细胞,观察其转导活性及细胞定位。结果重组原核表达质粒pCTP-OD-HA经酶切及测序鉴定,证明构建正确。37℃,1 mmol/LIPTG诱导4h,目的蛋白的表达量最高,约占菌体总蛋白的35%,纯化后纯度达95%以上。FITC-CTP-OD-HA融合蛋白在K562细胞中具有高转导活性和显著的胞浆定位特性。结论已成功构建CTP-OD-HA融合基因原核表达质粒,并高效表达了目的蛋白,为进一步研究其在CML信号转导通路中的作用,阐明CML的发病机制及探讨蛋白肽在CML中的治疗策略奠定了基础。     

Apg-2过表达对BaF3-MIGR1及稳定表达BCR/ABL的BaF3-P210细胞增殖的影响

目的探讨热休克蛋白Apg-2过表达对小鼠pMIGR1空载体感染细胞BaF3-MIGR1和BCR/ABL转化细胞BaF3-P210(简称BP210)增殖的影响。方法构建pIERS2-EGFP-Apg-2真核表达质粒,电穿孔转染BaF3-MIGR1和BP210细胞,经G418筛选稳定表达细胞株,分别用RT-PCR和Western blot鉴定Apg-2的表达。采用Am-Blue法和流式细胞仪(FCM)检测Apg-2过表达对BaF3-MIGR1和BP210细胞增殖的影响,光镜观察细胞形态变化。结果pIERS2-EGFP-Apg-2真核表达质粒构建正确,转染细胞后筛选到稳定过表达Apg-2的BaF3-MIGR1-Apg-2和BP210-Apg-2细胞株,BaF3-MIGR1-Apg-2细胞的增殖速度明显低于BaF3-MIGR1细胞,BP210-Apg-2细胞比BP210细胞增殖加快。光镜下可见Apg-2过表达的两种细胞形态发生变化,瑞氏染色可见细胞核增多。结论Apg-2能够促进BCR/ABL阳性细胞的增殖,可能与慢性粒细胞白血病的发生发展相关。     

嵌合泛素连接酶TrCP-CC及其突变体△F-CC重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建嵌合泛素连接酶TrCP-CC及其突变体△F-CC的重组腺病毒,并检测其表达。方法采用PCR和重叠PCR法构建真核表达质粒Migr1-TrCP-CC-HA和Migr1-△F-CC-HA,以此为模板,通过PCR将其克隆至穿梭质粒pAd-Track-CMV,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-TrCP-CC和pAdTrack-△F-CC,再与骨架载体pAdeasy-1经同源重组得到重组腺病毒质粒pAd-TrCP-CC和pAd-△F-CC,转染HEK293细胞进行包装扩增,得到重组腺病毒Ad-TrCP-CC和Ad-△F-CC,测定其滴度,并经RT-PCR检测目的基因的转录水平。结果经酶切和测序证实重组腺病毒质粒pAd-TrCP-CC和pAd-△F-CC构建正确,经HEK293细胞包装后显微镜下可观察到绿色荧光,病毒滴度分别为2.5×109和1.0×109pfu/L,经RT-PCR检测目的基因可有效表达。结论已成功构建重组腺病毒Ad-TrCP-CC和Ad-△F-CC,并在HEK293细胞中成功表达,为进一步研究其靶向融合蛋白Bcr-Abl泛素化和降解的机制奠定了基础。