肠道病毒71型多克隆抗体F(ab’)2片段的制备及其体外中和效果评价

目的制备肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)多克隆抗体F(ab’)2片段,并评价其体外中和效果。方法采用硫酸铵分级沉淀法从EV71感染的兔血清中提取Ig G,用胃蛋白酶进行酶解,正交试验确定最佳酶解条件;使用阴离子交换层析(Q Sepharose Fast Flow)纯化得到F(ab’)2片段,采用体外中和试验检测其对EV71的中和效果。结果硫酸铵分级沉淀法得到电泳纯的Ig G;最佳酶解条件为:胃蛋白酶与Ig G按1∶10的质量比混合,47℃反应4 h,在此条件下,F(ab’)2的产率最大值为79.51%,且方差分析表明,酶切比例对F(ab’)2产率的影响最大,温度次之,时间对F(ab’)2产率的影响不明显;经阴离子交换层析纯化,可有效去除Fc片段,得到电泳纯的F(ab’)2;F(ab’)2具有与Ig G、正常血清同等的中和效果。结论成功制备了EV71兔多克隆抗体F(ab’)2片段,初步确定该F(ab’)2片段具有良好的体外中和效果。     

柯萨奇病毒A组16型疫苗候选株减毒特性的分析

目的对柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CA16)减毒活疫苗候选株进行初步分析,为CA16减毒活疫苗的研制奠定基础。方法将两株CA16疫苗候选株(KM168和KM154)进行低温连续传代减毒,对不同代次病毒进行减毒特性的分析。将候选株病毒收获液免疫ICR乳鼠(颅内注射)及ICR成鼠(腹腔注射),分别评价减毒疫苗候选株的毒力、免疫原性以及乳鼠作为减毒活疫苗残余毒力评价动物模型的可行性;对病毒进行VP1片段的测序,分析遗传稳定性。结果两个候选株经低温连续传代后,均具有稳定的生长特性及良好的免疫原性,感染性滴度均保持在约7.0 Lg CCID50/ml,免疫小鼠后抗体阳转率达100%,最高GMT约1∶30。乳鼠及成鼠感染病毒后,在大部分组织中能检测到CA16病毒;KM154株在第12代后未对乳鼠产生临床致病性及致死率,病理检测结果主要表现为少量炎性细胞集结,无明显组织损伤,随着传代增加,组织损伤明显减少。两个候选株经低温连续传代后,能保证VP1片段的遗传稳定性。结论低温连续传代可使CA16的毒力明显降低,有望筛选出减毒活疫苗的候选株;1~2日龄ICR乳鼠可以作为CA16减毒活疫苗的候选株毒力评价的动物模型。     

Al(OH)_3佐剂对不同抗原含量肠道病毒71型灭活疫苗免疫效果的影响

目的分析Al(OH)3佐剂对不同抗原含量肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)灭活疫苗免疫效果的影响。方法将ICR小鼠随机分为9组,每组8只:常规剂量(160 EU/0.1 ml EV71)、1/2剂量(80 EU/0.1 ml EV71)、1/5剂量(32 EU/0.1 ml EV71)无佐剂及佐剂[Al(OH)31.0 mg/ml]疫苗组,并设佐剂、生理盐水及空白对照组,分别于0、28 d经肌肉免疫小鼠,分别于初免及加强免疫后28 d,经尾静脉采血,分离血清,采用体外微量中和试验法检测小鼠血清中和抗体效价,流式细胞仪检测IL-2、IL-4、IL-6、IL-17A、IL-10、IFNγ及TNF水平。结果初免后28 d,1/2剂量疫苗组中佐剂组小鼠血清抗体阳性率明显高于无佐剂疫苗组,差异有统计学意义(P<0.05),其余各组间差异无统计学意义(P>0.05);加强免疫后28 d,常规剂量疫苗组中,佐剂及无佐剂组小鼠血清抗体阳性率均为100%,抗体GMT分别为1∶152.2和1∶139.6,1/2剂量疫苗组中,佐剂组小鼠血清中抗体GMT与无佐剂组相比,差异有统计学意义(P<0.05),其余组间抗体阳性率及抗体GMT差异均无统计学意义(P>0.05)。常规剂量、1/2剂量、1/5剂量疫苗组,均诱导产生IL-6、IL-10、IFNγ及TNF 4种细胞因子,与佐剂对照组和生理盐水对照组相比,差异有统计学意义(P﹤0.05),未检测到IL-2、IL-4、IL-17A。结论 EV71灭活疫苗可诱导小鼠产生IL-6、IL-10、IFNγ、TNF 4种细胞因子及特异性的抗EV71抗体,加入佐剂后免疫效果更好。