Real-time PCR检测核酸疫苗中宿主基因组残留DNA

目的建立Real-time PCR方法,用于定量检测核酸疫苗中宿主基因组的残留DNA。方法以Lightcycler平台为基础,选择大肠杆菌23S核糖体RNA基因为靶标基因设计扩增引物,建立基于SYBR GreenⅠ荧光染料的Real-time PCR检测方法,并用于核酸疫苗纯化过程中间产物的检测。结果整个检测过程可在30min内完成,特异性强,检测灵敏度可达10fg/μl,其标准曲线的相关系数为-0.99。结论该方法可用于核酸疫苗中宿主基因组残留DNA的检测。     

重组HIV-1 CN54 Nef抗原的制备及鉴定

目的原核表达HIV-1CN54调控蛋白Nef,并进行纯化、复性及鉴定。方法将CN54 Nef基因克隆至pThio-HisA载体,构建非融合表达载体,转化大肠杆菌BL21 Codonplus-RIL,IPTG诱导表达,通过尿素梯度洗涤包涵体纯化Nef蛋白,透析复性。Western blot检测目的蛋白的特异性。结果Nef蛋白以包涵体的形式表达,表达量占菌体总蛋白的40%以上。用尿素洗涤法可直接纯化Nef,纯度达到90%以上。Nef蛋白透析后溶解于PBS缓冲液中。Western blot检测显示了良好的特异性。结论HIV-1 CN54 Nef抗原蛋白可在大肠杆菌中高效表达,采用的纯化和复性Nef蛋白的工艺简便、快捷,为开发针对Nef基因的HIV-1疫苗奠定了基础。