pRL-hTNF/JM103工程菌发酵和rhTNFα表达的研究

为便于下游中试规模生产,采用温度敏感型启动子PRPL构建rhTNFα工程菌,并对影响工程菌发酵培养和表达的因素进行了初步研究。结果显示,采用RTB培养基,50℃热水快速升温,诱导培养4～4．5h,湿菌体收获率和表达量均达到较高水平;50L发酵罐连续发酵3批,14000r／min连续离心,菌体收获率湿重达16．gg／L培养物,rhTNFα表达量占菌体总蛋白的10.5％,活性达1．35×107U／mg蛋白。.     

抑制消减杂交法分离血管内皮细胞中表达的TNFα相关基因

介绍使用快速而高效地分离差别表达基因的新方法———抑制消减杂交法 ,克隆了在TNFα作用后血管内皮细胞中的差异表达cDNA。经反向Northern杂交试验证实。为进一步研究血管内皮细胞中表达的TNFα作用相关基因打下基础。     

应用带HSV－TK基因的重组腺病毒的肺癌基因治疗的研究

带有单纯疱疹病毒脱氧胸苷激酶基因（ＨＳＶ－ｔｋ）的腺病毒结合ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ（ＧＣＶ）对分裂细胞有很强的杀伤作用。本文报道在感染复数（Ｍ．Ｏ．Ｉ,ＭｕｌｔｉＰｌｉｃｉｔｙｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｎ）达到１０００时对人体肺腺癌细胞Ａ５４９的杀伤几乎达到回１００％。四种人体肺癌细胞株（Ａ５４９,ＬＡＸ,ＳＰＣ,ＳＫＹ）对带ＨＳＶ－ｔｋ的腺病毒（ＡＤＶ／ＲＳＶ－ｔＫ）的杀伤作用表现不同的敏感性。另外,Ａｃｙｃｌｏｖｉｒ（ＡＣＶ）和ＧＣＶ对感染了重组腺病毒ＡＤＶ／ＲＳＶ－ｔＫ的细胞都有一定杀伤作用,但杀伤效果有很大差别;就Ａ５４９而言,ＧＣＶ的杀伤作用比ＡＣＶ高７—８倍。此外ＡＤＶ／ＲＳＶ－ｔｋ结合ＧＣＶ杀伤肿瘤细胞时有“旁观者效应”,即感染了ＡＤＶ／ＲＳＶ－ｔｋ的细胞与未感染细胞混合后,后者也明显地遭到杀伤。     

重组人肿瘤坏死因子α的分离纯化及鉴定

重组人肿瘤坏死因子α工程菌经发酵培养、破菌后,上清再经热处理、硫酸按分级沉淀,然后过SephadexG－25、DEANSepharoseCL-6B和Sephacry1S-100柱层析进行再纯化。结果显示,经多步层析纯化后rhTNFa回收率达27％,纯化倍数达236倍。连续纯化3批,纯度均达96％以上,比活性达3．9×106U／mg蛋白。提示所建立的纯化工艺稳定,为rhTNFα的基础研究和临床研究奠定了基础。     

带HSV—tk基因的重组腺病毒治疗小鼠实体瘤的研究

在完成一系列离体实验川的基础上进一步进行了活体研究，离体实验表明，小鼠肉瘤细胞5180在感染重组腺病毒ADV／RSV－tk后对GCV的处理显示出致死敏感性。因4L以S180肿瘤细胞进行活体实验，小鼠腋下接种3×106S180细胞，当能触摸到瘤块时在瘤内注入ADV／RSV－tk，并腹腔注射GCV连续五天；种瘤后10天杀死小鼠剥离瘤块称重，治疗组瘤重为对照组的1／14。实验结果表明，以腺病毒为载体介导HSV－tk基因结合GCV作用对肿瘤细胞有强杀伤性，是有应用前景的肿瘤基因治疗的一种疗法。