人组织激肽释放酶基因的克隆及融合蛋白的表达

目的 开发激肽释放酶基因工程产品,为开展基因治疗高血压奠定基础。方法 采用RT-PCR的方法合成人胰腺 cDNA,从中扩增出Kallikrein(KK)基因。经 XhoI和EcoR I双酶切后,连接到pET-28b(+)载体上,酶切鉴定后,进行核苷酸序列分析和融合蛋白的表达。结果 将IPTG诱导表达的菌体进行SDS-PAGE电泳,与蛋白标准品比较,在相对分子质量31800处可见明显的高表达带。免疫印迹实验表明重组蛋白具有KK的抗原性。结论 已成功克隆并表达了人胰腺组织激肽释放酶基因,为进一步开发基因工程产品及进行基因治疗高血压研究打下了基础。     

人组织激肽释放酶成熟蛋白的纯化及活性分析

目的　制备纯化人组织激肽释放酶 ,并检测其生物活性 ,为中试放大及纯化工艺奠定基础。方法　使用麦芽糖 (MBP)融合分泌载体pMBP P ,构建并筛选出 1株工程菌株 ,在 6L培养基中经IPIG诱导表达人组织激肽释放酶融合蛋白。目的蛋白经亲和层析纯化及凝血酶切割后 ,采用电位滴度法测定其活力。结果　筛选出的工程菌株表达相对分子质量约 70 0 0 0的激肽释放酶融合蛋白 ,大小与预计大小相符。纯化后共获得 2 8mg蛋白 ,并具有水解苯甲酰精胺酸乙酯 (BAEE)的能力。结论　成功进行了人组织激肽释放酶融合成熟蛋白的小量制备 ,经纯化后的产物具有生物活性 ,为中试放大、纯化工艺研究奠定了基础。