奇异变形杆菌疫苗候选抗原的鉴定及其免疫保护效果评价

目的 鉴定奇异变形杆菌疫苗候选抗原,并评价其在小鼠体内的免疫保护效果。方法 采用细菌膜蛋白提取试剂盒提取奇异变形杆菌膜蛋白,进行Western blot检测及质谱分析。化学法合成外膜蛋白F(outer membrane protein F,OmpF)及丝氨酸水解酶（serine hydrolase,SH）两种膜蛋白的编码基因,克隆至载体pET-28a,于E.coli BL21(DE3)诱导表达重组蛋白,进行Western blot检测。重组蛋白通过Ni Sepharose High Performance纯化后,经腿部肌内注射15只雌性昆明小鼠,100μg/（0.2 mL·只）,共免疫3次,间隔2周。末次免疫后15 d,经眶前静脉窦采血,分离血清,间接ELISA法检测特异性抗体水平;经小鼠腹腔接种致死剂量的奇异变形杆菌,接种1个月,观察小鼠存活情况,并计算抗原的免疫保护率。结果 提取的膜蛋白可与奇异变形杆菌免疫小鼠抗血清发生特异性结合,经质谱鉴定与奇异变形杆菌APB87305(OmpF)、WP＿004247605(SH)的同源性为100%。原核表达的重组蛋白OmpF及SH可与奇异变形杆...     

兔出血症病毒衣壳蛋白VP60抗原区的原核表达及其免疫保护效果

目的 原核表达兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)衣壳蛋白VP60抗原区,并检测其免疫保护效果.方法 采用RT-PCR法从感染RHDV死兔肝脏中扩增RHDV VP60基因,克隆基因并进行测序和生物信息学分析.用柔性连接肽(Gly4Ser)3串联VP60蛋白两抗原区域...     

富含Trp/Arg六肽对糖尿病小鼠皮肤创伤愈合的影响

目的探讨富含Trp/Arg六肽对糖尿病小鼠皮肤创伤愈合的影响。方法经小鼠腹腔注射链脲佐菌素建立小鼠糖尿病模型,在糖尿病小鼠背部切取直径8 mm的圆形全层皮肤,形成皮肤损伤模型。将皮肤损伤模型小鼠随机分为富含Trp/Arg六肽RRWWCR、RRWWFR、RRWWTR组和生理盐水组,分别在创伤形成同时,在伤口处擦拭0.1 mg/ml相应药物,每只0.2 ml,开放式治疗10 d,每天1次。每天观察创面形态变化,并测量创面直径;每5 d取附带周围正常组织的创面全层皮肤,进行组织病理学观察。结果 RRWWCR和RRWWTR可促进创面组织的修复,表现为加强早期炎症反应、促进新生血管、肉芽组织和再上皮化形成以及缩短创面愈合时间。结论富含Trp/Arg六肽对糖尿病小鼠皮肤创伤愈合具有促进作用,其第5位氨基酸残基极性可极大地影响其促修复能力。     

噬菌体展示颗粒疫苗的研究进展

噬菌体是以细菌为宿主的病毒,具有严格的宿主特异性,只"寄生"在易感宿主菌体内,对动植物细胞无毒性。噬菌体结构简单,基因数少,是分子生物学与基因工程的良好操作系统。建立在噬菌体展示技术基础上的噬菌体颗粒,因其安全可靠,免疫效果好,在预防性和治疗性疫苗的研究中取得良好效果,表明噬菌体作为疫苗载体用于疫苗学的研究是一种新的发展方向,对新型疫苗的开发具有重要意义。本文就噬菌体颗粒用于疫苗研究的优势、研究进展及其应用前景作一综述。     

山羊地方性鼻内肿瘤病毒重庆株基因组序列分析

目的分析山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus,ENTV)重庆株基因组序列。方法对临床病例进行剖检、病理学观察,提取组织总RNA,进行RT-PCR扩增,对获得的ENTV-2基因组序列进行测定及分析。结果鼻内肿瘤在鼻腔后端与鼻甲筛骨黏膜紧密相连,完全阻塞鼻腔,侵入鼻窦,呈灰红色、乳头状,表面覆盖大量透明黏液。肿瘤细胞以管状和乳头状结构排列。拼接出1条长度为7 243 nt的ENTV-2 CQ株基因组序列,约占ENTV-2基因组长度的96. 2%。该序列与四川ENTV-2的同源性,最高大于97%,与山羊内源性逆转录病毒(caprine endogenous retrovirus,CERV)gag(XM_018046415_CERV)的同源性高于98%,与陕西ENTV-2的同源性为91%～92%,与英国ENTV-2(AY197548)的同源性为88%。多序列比对显示,CQ株gag基因有2处多核苷酸插入,这一序列特征与XM_018046415_CERV的gag基因相同。除了AY197548_ENTV-2单独构成Ⅱ群外,ENTV-2在羊反转录病毒进化树中构成Ⅰ群;CQ株与四川ENTV-2构成一分支,与陕西ENTV-2构成另一分支。结论该病例为山羊地方性鼻内肿瘤(enzootic nasal tumor,ENT),提示其病原可能是1株古老ENTV-2毒株,有遗传多样性。     

重庆地区中蜂囊状幼虫病病毒型特异性遗传变异分析

目的分析重庆地区中蜂囊状幼虫病病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)的遗传多样性。方法采用RT-PCR法从重庆地区中蜂囊状幼虫病病死幼虫体内扩增CSBV的2段结构蛋白和1段非结构蛋白的编码序列,并克隆至pMD18-T载体进行双向序列测定,所得序列在NCBI上进行BLAST搜索,以进行同源性分析;应用ClustalW2软件进行多序列比对分析;应用SNAP软件计算同义替换率(Synonymous substitution rate,dS)、非同义替换率(Nonsynon-ymous substitution rate,dN)及其比值(dS/dN);采用MEGA 4软件的邻接法(Neighbor-joining)中的最大可能性算法(Maximum likelihood method)构建系统进化树。结果 CSBV重庆分离株片段SB1-2、SB6-7和SB14-15的序列同源性高于99.06%,序列保守,3个片段序列均只发现少数点变异碱基,属于亚洲型,与东方蜜蜂广州分离株和韩国分离株的亲缘关系最近;CSBV重庆分离株存在特有的核苷酸和氨基酸位点,且与亚洲型分离株存在广泛的共有基序;亚洲型分离株的替换率高于欧洲型分离株。结论 CSBV分离株存在型特异的遗传变异规律。     

化脓隐秘杆菌溶血素和铁结合蛋白的抗体应答分析

目的 对化脓隐秘杆菌（Trueperella pyogenes）溶血素（pyolysin,PLO）和铁结合蛋白（iron-binding protein,IBP）的抗体应答情况进行分析。方法 采用腹腔注射途径建立化脓隐秘杆菌小鼠感染模型,观察不同剂量细菌对小鼠的致死性和注射部位形成的组织病变。制备化脓隐秘杆菌灭活抗原,采用肌肉注射途径免疫45只雌性昆明小鼠和10只山羊,每只小鼠0.2 mL,每只山羊1 mL,均进行3次免疫,每次间隔2周,第3次免疫后2周采血分离血清。采用ELISA法测定感染小鼠、健康圈养羔羊、化脓隐秘杆菌灭活抗原免疫小鼠和山羊血清中抗PLO和IBP的IgG抗体水平。结果 注射部位出现化脓和皮肤坏死的小鼠血清中能检出高水平的抗PLO和IBP抗体;无组织病变小鼠血清中仅能检测到低水平的抗IBP抗体;连续注射无组织病变剂量细菌的小鼠血清能检出抗PLO和IBP抗体。圈养羔羊血清抗PLO抗体阳性率高,而抗体水平低。免疫小鼠和山羊血清中均能检出抗IBP抗体,但部分动物检测不出抗PLO抗体。结论 IBP是化脓隐秘杆菌感染和灭活疫苗免疫诱导抗体应答的主要抗原之一,PLO抗体水平具有反...     

猪圆环病毒2型ORF2与猪繁殖及呼吸综合征病毒ORF5嵌合抗原表位在乳酸乳球菌中的表达

目的乳酸乳球菌中表达猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)ORF2与猪繁殖及呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)ORF5的嵌合抗原表位。方法按乳酸乳球菌密码子使用偏好设计并合成PCV2 ORF2及PRRSV ORF5的串联抗原表位基因,插入至乳酸菌表达质粒p NZ8148,构建重组表达质粒,转化乳酸乳球菌NZ9000中,经乳酸菌素(nisin)诱导表达嵌合蛋白,采用Ni-NTA亲和层析纯化,进行12%SDS-PAGE分析。结果重组表达质粒经双酶切鉴定,构建正确。嵌合蛋白相对分子质量约25 000,在乳酸乳球菌中主要以可溶性形式表达,纯化后纯度达96%以上,浓度约1 mg/m L,产量可达60 mg/L细菌培养物。结论 PCV2ORF2与PRRSV ORF5的嵌合抗原表位在乳酸乳球菌中得到高效可溶性表达。     

中蜂囊状幼虫病病毒结构蛋白的表达及其抗血清的制备

目的原核表达中蜂囊状幼虫病病毒(Chinese sarbood virus,CSBV)结构蛋白,并制备其抗血清。方法采用RT-PCR法扩增CSBV结构蛋白基因片段,克隆至pGEX-4T-1载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经Gluthathione-Sepharose 4B亲和层析纯化后,免疫小鼠,制备抗血清,并进行Western blot鉴定。结果重组表达质粒经菌落PCR鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约52 000,以可溶性形式表达;纯化后纯度可达95%以上;制备的抗血清可识别天然CSBV结构蛋白。结论成功在大肠杆菌中表达了CSBV结构蛋白,并制备了其抗血清,为进一步研究囊状幼虫病病毒与宿主的相互作用及开发血清学诊断方法奠定了基础。