转化生长因子-β1基因shRNA表达质粒的构建及其对结肠癌细胞SW480侵袭能力的影响

目的构建转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)基因短发夹RNA(Short hairpin RNA,shRNA)表达质粒,并观察其对结肠癌细胞SW480侵袭能力的影响。方法设计并合成2对靶向TGF-β1基因的RNA干扰序列和1对阴性对照序列,并构建重组表达质粒pshRNA-TGF-β1a、pshRNA-TGF-β1b和pshRNA-TGF-β1c(阴性对照),以脂质体介导转染SW480细胞,荧光显微镜观察转染情况;RT-PCR和Western blot检测转染细胞中TGF-β1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平;Transwell侵袭试验检测沉默TGF-β1基因表达对细胞侵袭能力的影响。结果 TGF-β1基因shRNA重组表达质粒经酶切鉴定和测序分析证明构建正确。与空白对照组相比,3种质粒转染的细胞均有较强的荧光表达;pshRNA-TGF-β1a和pshRNA-TGF-β1b组细胞TGF-β1基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均明显减低(P<0.05);SW480细胞的侵袭能力也明显降低(P<0.05)。结论成功构建了TGF-β1基因shRNA重组表达质粒,其能有效抑制结肠癌细胞SW480中TGF-β1基因的表达,并可显著降低细胞的侵袭能力,为结肠癌的基因治疗提供了新的思路。     

尼美舒利联合5-Fu对胃癌细胞BGC-823的抗癌作用研究

目的 :研究尼美舒利 (Nimesulide)合用 5 -Fluorouracil(5 -FU)对人胃癌细胞株BGC -82 3的生长抑制作用 ,判断联合用药的效果。方法 :采用MTT法、中效原理等测定药物的体外杀伤作用 ,进行联合用药分析。结果 :尼美舒利合用 5 -FU能显著抑制BGC -82 3的生长 ,当抑制率为 10 -95 %时 ,两药合用时合用指数 (CI) <1,为协同作用 ,使用药浓度减少 1-10倍。结论 :尼美舒利联合 5 -FU能显著增加单用其中一种药物对人胃癌细胞株BGC -82 3的抑制作用 ,两药联合应用时具有较好的协同作用。     

槲皮素对BGC823胃癌细胞p53、Bcl-2/Bax、PCNA表达影响与抑癌作用研究

目的：观察槲皮素对胃癌细胞BGC823生长及p53、Bcl-2／Bax、PCNA的影响。方法：以台盼蓝拒染法计数胃癌细胞的生长抑制率,透射电镜从形态变化上了解凋亡的发生,流式细胞术检测细胞周期变化,免疫细胞化学检测p53、Bcl-2／Bax、PCNA蛋白的表达。结果：台盼蓝拒染法计数显示槲皮素抑制BGC823细胞增殖的作用明显,且呈浓度和时间依赖性,槲皮素处理48h后的Ic50为28．12μm。形态学检测显示出细胞凋亡的特征变化,流式细胞仪检测表明经10—20μm／L的槲皮素处理,BGC823细胞周期阻滞于S期,药物浓度呈正相关。细胞呈现核固缩、染色质边集、凋亡小体形成等典型凋亡表现。经槲皮素处理后BGC823细胞株bax蛋白表达明显增加,bcl-2、PCNA、p53蛋白表达降低。结论：槲皮素能抑制胃癌细胞的生长,呈时间剂量依赖性,能诱导BGC823发生凋亡,使细胞周期阻滞于S期,抑制增生与诱导凋亡的机制可能与下调p53、PCNA的表达,降低bcl-2／Bax比值有关。     

人幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI基因穿梭质粒的构建及表达

目的构建人幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒,并在耻垢分枝杆菌中进行表达。方法PCR扩增幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI编码基因全长片段,克隆入pET32a(+)质粒,鉴定正确后,再亚克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pJHSP70,构建分枝杆菌穿梭表达质粒pJHSP70-UreI,转化耻垢分枝杆菌,诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blot检测。结果从幽门螺杆菌基因组中扩增出585bp的UreI基因片段。重组质粒pJHSP70-UreI经酶切和PCR鉴定,与预期结果一致。目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的18.5%,且具有良好的反应原性。结论已成功构建了幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI基因大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒,并在耻垢分枝杆菌中获得表达。