细胞ELISA法的建立及应用

应用刀豆素蛋白A为结合剂将细胞结合于酶标板的细胞ELISA法(C-ELISA),检测几种抗细胞膜抗原单抗和筛选抗细胞膜抗原单抗,均显示具有较好的特异性和重复性。在筛选杂交瘤上清时,该法较间接免疫荧光法敏感、简便。     

人TRAIL细胞外段基因在大肠杆菌中的表达及其包涵体的复性

目的　在大肠杆菌中表达人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段 (sTRAIL)基因 ,并研究其包涵体的复性。方法　应用RT- PCR法从正常人外周血单核细胞中获得sTRAIL的编码基因 ,将其克隆到原核表达载体pBV2 2 0 ,于大肠杆菌DH5α中通过温控诱导表达 ;将包涵体进行变性和复性处理后 ,采用离子交换层析纯化表达产物 ,并经Dotblot及MTT试验鉴定。结果　通过温度诱导 ,目的基因主要以包涵体形式高效表达 ,包涵体蛋白经梯度透析法复性可获得具有抗肿瘤活性的重组人sTRAIL。结论　已获得大量纯化重组人sTRAIL ,为开发新型抗肿瘤制剂奠定基础。     

细菌内同源重组构建人p21~(WAF1)基因重组腺病毒

目的构建人p21WAF1基因重组腺病毒载体,并在293细胞中包装制备重组腺病毒。方法将人p21WAF1基因亚克隆连接到腺病毒转移质粒pshuttle-cmv,得到阳性重组转移质粒psh-p21。先将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1转化BJ5183菌,筛选得到AdBJ5183菌,再将PmeⅠ线性化的psh-p21转化AdBJ5183菌,经细菌内同源重组法构建重组腺病毒质粒pAdp21。经PacⅠ和BstXⅠ酶切及PCR鉴定,将正确的重组腺病毒质粒pAdp21转染293细胞包装病毒,用RT-PCR和PCR鉴定重组腺病毒及其稳定性。结果所构建的重组腺病毒质粒pAdp21,经PCR鉴定,可扩增出约500bp的片段,与预期大小相符。转染293细胞可包装成p21WAF1基因重组腺病毒,经电镜观察,具有典型的腺病毒特征。结论已成功地构建了重组腺病毒质粒pAdp21,并制备出重组腺病毒rAdp21。     

抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段单克隆抗体的制备

目的制备抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段(sTRAIL)的单克隆抗体。方法用重组sTRAIL免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,捕获ELISA筛选阳性克隆,制备腹水抗体。间接ELISA测定单抗效价,并进行单抗亚类、特异性鉴定及杂交瘤细胞染色体和单抗识别位点分析。将杂交瘤细胞体外连续培养3个月及冻存6个月后,检测细胞培养上清的效价。结果3株杂交瘤细胞分泌的单抗均为IgG1型,腹水单抗效价均高于10-6,杂交瘤细胞染色体数介于94～98条之间,均识别sTRAIL分子上线性表位。细胞体外连续培养3个月及冻存6个月后的上清效价保持稳定。结论已成功制备了3株可稳定分泌抗sTRAIL单克隆抗体的杂交瘤细胞,为TRAIL的定性定量检测及组织表达分析奠定了基础。