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磷脂酶D（Phospholipase D, PLD, EC 3.1.4.4）是催化磷脂的磷酸二酯键水解和转磷脂酰基反应的一类酶的总称。PLD所具有的转磷脂活性使其在食品、医药以及细胞生物学等领域具有广泛的应用价值,但其大规模工业化生产受到诸多因素的限制。利用基因工程技术对磷脂酶D基因进行克隆表达,开发高产量、高纯度和高转磷脂活性的PLD资源成为当前的研究热点。本文主要对微生物PLD克隆与高效表达方面的研究进展进行分析,以期对微生物PLD的大规模生产及其相关产品的开发利用提供参考。 相似文献
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为了获得性能优良的新型β-甘露聚糖酶,本研究采用基因挖掘技术从米曲霉(Aspergillus oryzae)RIB40基因组中挖掘到了2个假定的新型GH5家族β-甘露聚糖酶基因,分别命名为Aoman5A和Aoman5B。对这两条序列做了相关的生物信息学分析,同时借助p PIC9KM质粒将两个酶的成熟肽编码基因在Pichia pastoris GS115中实现了表达,并对表达产物进行了纯化和鉴定。生物信息学分析的结果表明Ao Man5A含有20个氨基酸残基的信号肽,而Ao Man5B含有21个氨基酸残基的信号肽和12个氨基酸残基的前导肽;序列比对的结果显示两个酶与目前已报道的序列最高的同源性分别为68%和79%,且Ao Man5A的N端还携带有一个1家族的CBM;三维结构预测的结果显示,两者均符合(α/β)8的TIM-桶状结构。表达鉴定的结果表明,在同样表达条件下,re Ao Man5A和re Ao Man5B上清液的酶活力分别为2.9、12.5 IU/m L;纯化后它们的酶比活力分别为8.3、104.2 IU/mg,前者的最适温度为35℃,而后者的最适温度为50℃,p H值特性的测定结果表明这两种酶均为酸性酶。硫酸-苯酚法测得re Ao Man5A和re Ao Man5B的糖含量分别为25.4%和12.6%,表明这两种重组酶均经过了糖基化修饰。本研究获得了两种新型的β-甘露聚糖酶,比较分析了它们的序列特征,并实现了它们的异源表达,为β-甘露聚糖酶的进一步研究及应用奠定了坚实的基础,也为其他新型酶的基因挖掘提供了可资借鉴的经验。 相似文献
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苯乙酮酸是化学合成中重要的合成砌块,可用于合成多种药物中间体,探索苯乙酮酸的绿色合成工艺具有重要的意义。以包含D-扁桃酸脱氢酶LhDMDH编码基因的重组大肠杆菌全细胞为催化剂,考察了它在无辅酶和辅底物添加的条件下对D-扁桃酸生物转化的效果,并对催化产物进行了纯化和鉴定。结果表明,本研究成功实现了在无辅酶和辅底物添加条件下苯乙酮酸的生物合成,产物的得率和纯度分别为45%和99%左右。成果也为外消旋扁桃酸的手性拆分及苯乙酮酸的生物合成奠定了基础。 相似文献
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目的改进头孢菌素C(cephalosporin C,CPC)乙酰化酶高通量筛选方法,获得催化活性显著提高的突变体。方法基于对二甲氨基苯甲醛(p-dimethylaminobenzaldehyde,p-DAB)与7-氨基头孢烷酸(7-amino cephalosporanic acid,7-ACA)的复合物在405 nm有最大吸收值的原理,采用无菌96孔深孔板对重组菌进行低温低浓度诱导剂诱导表达,再以含溶菌酶和DNase的缓冲液进行菌体裂解,最后以96孔板进行底物的水解和反应终止,经p-DAB显色后,利用酶标仪进行产物的快速定量,以实现CPC乙酰化酶突变体的高通量筛选。结果利用改进的p-DAB比色法从先前建立的突变文库中筛选到2个在13℃下比酶活明显提高的突变子1A10和2G8,其比酶活分别为1.7和2.4 U/mg,较原酶的0.85 U/mg显著提高。在优化的筛选条件下,A405的变化能够准确反映酶活性的大小,确保了该方法筛选结果的可信度。结论改进的p-DAB比色法具有筛选快速,操作简便,筛选通量大及准确度高等优点,能够提高CPC乙酰化酶改造及筛选的效率,为低温CPC乙酰化酶的创制提供了技术支持。 相似文献
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