重组大肠杆菌1,2,4-丁三醇合成途径的平衡优化

1,2,4-丁三醇(1,2,4-butantriol,BT)属于非天然化学品,是军工材料1,2,4-丁三醇三硝酸酯的前体。在重组大肠杆菌中,木糖经脱氢、脱水、脱羧和还原合成BT。但途径各反应不平衡使得中间代谢物积累限制菌体生长和产物合成。本研究首先通过CRISPR/Cas9敲除基因yjh G和yqh D构建无本底表达宿主菌,随后利用不同启动子组合调节BT合成途径中基因xdh、yjh G和yqh D的表达。结果发现,以P_inv表达醇脱氢酶基因yqh D使BT产量达到14.4g/L;以P_tac表达脱氢酶基因xdh和P_{rrn HP1}表达脱水酶基因yjh G的组合方式,BT产量达到15.6g/L,比对照菌株KXW3009分别增加5.9%和14.7%。本研究通过对中间代谢物木糖酸合成和代谢的组合优化,促进了BT的合成,为后续研究提供了借鉴。     

牡丹提取物及乳酸菌替代低温火腿肠中亚硝酸盐的研究

研究了牡丹提取物及乳酸菌发酵液替代亚硝酸钠对低温火腿肠颜色、质构、脂质氧化程度、菌落总数及风味的影响。结果表明,0.3%牡丹提取物和3%乳酸菌发酵液可替代低温火腿肠中2/3亚硝酸钠用量,其火腿肠红度值(a*)及脂肪氧化程度与添加150mg/kg亚硝酸钠效果相当,且能保持火腿肠良好的质构特性;添加牡丹提取物及乳酸菌发酵液,可使火腿肠菌落总数显著降低(P0.05),延长火腿肠货架期。与空白对照相比,复配火腿肠中醛类和酮类物质相对含量降低,酸类、酯类等挥发性风味物质相对含量增加较为显著,其中己酸乙酯含量提高了1.7倍;2-戊基呋喃和麦芽酚等其它风味物质相对含量亦有所升高,总体感官评价较好。     

安全酵母Candida glycerinogenesis食品级甘油合成关键基因的研究

为了研究酵母甘油合成关键酶基因在食品级甘油合成中的重要作用,以产甘油假丝酵母基因组为模板,设计引物,克隆获得甘油合成关键酶基因3-磷酸-甘油脱氢酶基因(CgGPD),并在大肠杆菌中通过tac启动子串联表达来自酿酒酵母的3-磷酸甘油酯酶基因(ScGPP2)。经IPTG诱导培养后,3-磷酸-甘油脱氢酶(CgGPD)的比酶活达到了60mU/mg。在30%的葡萄糖浓度下,经过48h的摇瓶发酵,可合成甘油2.52g/L。表明3-磷酸甘油酯酶在甘油合成过程中起了关键作用,过表达CgGPD基因有助于食品级甘油大量合成,从而降低下游分离纯化的难度,可从分子水平进一步提高甘油的产量。     

1,2,4-丁三醇的双水相萃取

对低分子有机溶剂/无机盐双水相体系萃取分离发酵液中1,2,4-丁三醇（1,2,4-butanetriol，BT）进行了深入研究。通过对不同双水相体系的筛选，最终选定无水乙醇/K₂HPO₄双水相体系来萃取分离BT。使用浊点法对以BT为溶剂的无水乙醇/K₂HPO₄双水相体系进行相图的绘制，发现在K₂HPO₄质量分数为19.83%~46.87%范围内均能成相。通过单因素实验，考察双水相体系中无水乙醇/K₂HPO₄质量分数、pH对BT在两相之间分配系数和萃取效率的影响，得到最佳萃取条件为：系统总量10g、pH 9.5，无水乙醇/K₂HPO₄的质量分数为28%/28%，分配系数和萃取效率分别可以达到18.35和95.87%。在最佳萃取条件下，进一步探究了放大实验对体系萃取效率的影响，发现其对分配系数和萃取效率影响较小，体系稳定性高，为工业提取发酵液中BT提供新思路。     

高渗工业菌株Candida glycerinogenes整合型表达载体的构建及验证

构建应用于工业用产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)CGMCC NO.6830的整合型表达载体,建立一种可利用底物形成的渗透压调控表达外源基因的体系。以p UC19质粒为基本骨架,C.glycerinogenes CGMCC NO.6830的18S r DNA为整合位点,运用其3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子PCggpd启动外源基因表达,腐草霉素抗性基因ble作为重组酵母转化子筛选标记,获得应用于产甘油假丝酵母的稳定的表达型整合载体;以绿色荧光蛋白基因gfp作为报告基因考察该表达质粒的性能,实现了外源基因gfp的渗透压调控表达。     

芍药花提取物对果蔬腐败菌的抑菌活性及其在樱桃番茄保鲜中的应用

以芍药(Paeonia lactiflora)花提取物为研究对象,通过抑菌圈、最低抑制浓度及最低致死浓度评价其对主要果蔬腐败菌的抑菌性能;通过提取物对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)生长、电导率、内容物质、可溶性糖的影响探究芍药花提取物的抑菌方式;对腐败率、失重率、可溶性固形物及Vc含量的测定考察提取物对樱桃番茄的保鲜效果。结果表明:芍药花提取物对细菌、酵母均有很强的抑制作用,尤其对枯草芽孢杆菌最低抑制质量浓度和最低致死质量浓度分别低至2 mg/mL和4 mg/mL;提取物通过增加细胞膜的通透性及破坏细胞膜的结构发挥抑菌作用;与对照相比,芍药花提取物能够明显降低樱桃番茄腐败率和失重率,减少可溶性固形物及Vc的损失,是一种具有应用前景的优良保鲜剂。     

米曲霉AAP新基因的异源表达及其酶学性质研究

通过生物信息学分析发现了米曲霉(Aspergillus oryzae)中属于氨肽酶M18家族的新成员天冬酰胺氨肽酶(AAP)基因,经反转录克隆获得该基因,实现了其在毕赤酵母GS115中的表达,同时研究了重组AAP的酶学性质及其在大豆蛋白水解中的应用。结果表明,重组AAP的分子质量约54.0 kDa,在较广的pH范围内有活性(pH 6.0～9.5),最适反应温度和pH分别为50℃和7.0,Zn~(2+)和Ca~(2+)对该酶起促进作用,EDTA能够显著抑制该酶的酶活。以Asp-pNA为底物时,K_m为0.42 mmol/L,V_(max)为21.57μmol/(mL·min),该酶具有水解N末端为天冬氨酸和谷氨酸的底物特异性。重组AAP可显著降低大豆多肽的苦味,提高水解度,具有在食品中的应用潜力。     

碳源对克氏菌合成PTT原料PDO的影响及对DhaB的表达调控

为提高1,3-丙二醇（PDO）产量,加快聚对苯二甲酸丙二醇酯（PTT）的产业化应用。考察了不同碳源对克雷伯氏菌合成PDO过程中碳流的影响和对关键酶DhaB的表达调控。结果表明,克雷伯氏菌不能直接利用葡萄糖合成PDO;以甘油为单一碳源时,PDO的产量仅为9 g/L,同时细胞生长受到一定抑制;而在甘油为底物的情况下,添加5 g/L的葡萄糖能够使菌体生物量提高66.7%、dhaB的转录上调20%、DhaB酶活提高64%,同时PDO产量提高1.5倍。上述结果表明混合碳源策略能够激活克雷伯氏菌PDO合成途径关键酶DhaB的表达,提高PDO的产量。     

Candida glycerinogenes基因组大片段缺失菌的构建及表征

通过基因组精简可获得代谢背景降低、更适用于工业生物技术的底盘细胞。产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)是具有优良抗逆性能的工业菌株，对其基因组进行精简以获得更优的底盘化细胞。以CRISPR/Cas9为工具进行C.glycerinogenes基因组非必需DNA大片段删除，实现了25、50 kb片段的敲除，并研究了缺失菌的耐受性和发酵特性。结果显示，片段删除菌株的胁迫耐受能力无明显改变，30℃下Δ7.8 kb菌生物量降低20%,42℃下Δ7.8 kb、Δ25 kb菌的生物量下降20%。而在发酵过程中各缺失菌均表现出生物量降低20%,其中Δ7.8 kb菌株表现出了发酵初生物量提高了14%、单位菌体甘油产量提高了22%,还原力相关基因G6PD、6PGDH分别上调10倍和29倍，NADPH/NADP⁺值提高了100%。结果表明，上述非必需DNA大片段删除对C.glycerinogenes耐受特性无明显影响，而会导致生物量降低和单位菌体甘油产量提高，缺失菌株可能因基因表达水平的差异而与野生菌株在性状上产生区别。该研究是对CRISPR/Cas9系统在C...     

利用一种新型羧肽酶M32制备低苦味豌豆低聚肽

该文研究了利用一种新型羧肽酶M32制备低苦味豌豆低聚肽的方法并进行了功能特性分析。结果表明羧肽酶M32酶解的最适条件为60℃,pH 7,酶解时间2 h,底物质量浓度60 g/L;羧肽酶M32结合碱性蛋白酶制备的豌豆低聚肽(pea protein isolate hydrolysed by alkaline protease and carboxypeptidase M32, PPIACP)的溶解性和水解度分别为80.6%和15.4%,与碱性蛋白酶单酶制备的豌豆低聚肽(pea protein isolate hydrolysed by alkaline protease, PPIA)相比，分别提高了37.4%和33.4%;PPIACP中分子质量在0.2～1 kDa的短肽与PPIA相比显著增加(P<0.05),增加了36.2%;鲜味氨基酸提高了3.8%,苦味氨基酸His、Arg、Val、Leu含量显著增加了17.4%(P<0.05),表明羧肽酶M32可将苦味肽C端的疏水性氨基酸(多为苦味氨基酸)释放出来，使其呈游离状态，降低苦味；电子舌结果显示，苦味值由5.09变为3.93,降...