改良RPMI1640培养基对CIK细胞增殖的影响

目的探讨改良RPMI1640培养基对CIK细胞体外增殖的影响,为临床治疗提供质量好、数量多的CIK细胞。方法用淋巴细胞分离液提取淋巴细胞,分别采用传统RPMI1640培养基和改良RPMI1640培养基培养,于培养当天及3、6、9、12、15、18d,采用台盼蓝拒染法计数细胞,检测细胞的增殖水平;流式细胞术分析细胞表型;MTT法检测CIK细胞的体外细胞毒活性。结果培养至第12天后,改良培养基培养条件下,CIK细胞的增殖倍数明显高于传统培养基培养的CIK细胞(P<0.05);CD3+CD56+细胞比例达33%以上;培养15d,对BGC-823和SPC-A-1细胞的细胞毒活性均高于传统培养基。结论改良RP-MI1640培养基较传统RPMI1640培养基可更好地促进CIK细胞增殖,为其临床应用提供了试验数据。     

可生物降解微球甲型肝炎减毒活疫苗口服免疫恒河猴的免疫应答

目的 探索用一种新型的甲型肝炎减毒活疫苗及其免疫途径。方法 用可生物降解的材料聚乳 酸／乙醇酸（ＰＬＡ／ＰＬＧ）包裹甲型肝炎减毒活疫苗,制成微球型疫苗,检测微球的大小及在体外病毒释放的状况,和口 服免疫恒河猴后病毒在体内繁殖及免疫应答状况。结果 微球大小在６～１０μｍ范围,体外病毒抗原释放长达２７ｄ 左右,体外抗原释放高峰在３～７ｄ,口服免疫恒河猴后,约１ｗ左右开始排毒,以后一直呈间断排毒。抗体应答于第 ３ｗ出现,高峰期在５～６ｗ,达１２６１ＭｍＩＵ／ｍｌ,随后逐渐下降,口服加强免疫后,抗体回升,野毒株攻击后,抗体再度回升 达１２４４ｍＩＵ／ｍｌ。结论 微球型甲型肝炎减毒活疫苗口服免疫恒河猴后,能引起一定水平的免疫应答。     

甲型肝炎灭活疫苗抗原剂量的优化

目的通过体内效力实验,优化甲肝灭活疫苗抗原最适免疫剂量。方法用1.0mg/ml Al(OH)3将不同梯度剂量的实验苗及参比苗4倍递增系列稀释,经腹腔免疫小白鼠,4周后采血,检测各免疫组小鼠血清甲肝抗体阳转率,用Reed-Muench法计算半数有效稀释倍数,比较抗原免疫剂量与半数有效稀释倍数之间的剂量-效应关系。结果甲肝灭活疫苗实验苗抗原免疫剂量与半数有效稀释倍数之间存在着良好的剂量-效应关系。结论半数有效稀释倍数可用于不同品牌甲型肝炎灭活疫苗效力的评价及最适抗原免疫剂量的优化。     

甲型肝炎病毒抗原定量参比品的研制

目的制备甲型肝炎病毒抗原定量参比品。方法依据《甲型肝炎灭活疫苗制造及检定规程》制备了1批甲肝病毒抗原参比品,并进行蛋白质含量测定、HAV蛋白纯度分析和酶标抗原含量标化。结果经纯化,杂蛋白去除率达99.9%,参比品的纯度大于95%;抗原含量在20~80 EU/ml范围内,抗原含量的对数与其A值呈剂量-效应关系。结论该参比品可用于甲肝病毒ELISA定性及定量标定。     

人源性抗甲型肝炎病毒Fab噬菌体抗体分子的初步筛选

目的从自建的大容量非免疫Fab噬菌体抗体库中筛选具有抗甲型肝炎病毒(HAV)抗原活性的噬菌体抗体,并进行鉴定。方法采用纯化的甲型肝炎病毒作为包被抗原,对自建的容量为1.26×1011pfu/ml的Fab噬菌体抗体库进行筛选和富集,分别对原始库和筛选后的抗体库进行Phage-ELISA和活性检测,经酶切鉴定和DNA测序分析后进行诱导表达。结果经2轮筛选,抗-HAV抗原的噬菌体抗体得到了明显富集,ELISA检测证实其具有良好的抗甲肝病毒抗原的特异性,抑制率为38.61%。酶切鉴定表明抗体库重组较稳定。SDS-PAGE检测显示Fab抗体蛋白在E.coliDH5α中得到了表达。结论从自建的非免疫Fab噬菌体抗体库中成功获得了抗甲肝病毒噬菌体抗体,所构建的非免疫抗体库可用于人源性抗体的筛选。     

应用二倍体细胞培养脊髓灰质炎病毒适宜条件的研究

目的 为用KMB17细胞制备口服脊髓灰质炎减毒活疫苗提供适宜条件。方法 检测不同培养液、不同代次、不同细胞龄和不同病毒感染量等因素对病毒滴度及产量的影响。结果 细胞对脊髓灰质炎病毒的敏感性随细胞龄的增加而降低，培养后24、48、72和96h单个细胞中脊髓灰质炎病毒产量分别为986、745、594和237 Lo-．gTCID50；细胞感染脊髓灰质炎病毒后出现细胞病变时间跨度大于48h，早期从病变细胞释放出的病毒在培养上清中不稳定，感染性滴度每24h降低0．25 LogTCID50以上。结论 KMB17细胞培养脊髓灰质炎病毒的感染性滴度和产毒量受培养液营养成分和病毒接种时细胞龄等条件的影响。     

甲型肝炎减毒活疫苗(H2株)和灭活疫苗(L8株)诱导小鼠体液及细胞免疫应答

目的评估甲型肝炎减毒活疫苗和灭活疫苗的免疫学效果。方法用甲型肝炎减毒活疫苗(H2株)和灭活疫苗(L8株)分别经腹腔免疫BALBc小鼠后,用ELISA法检测血清中抗HAVIgG、TNFα、IFNγ和IL2;用流式细胞仪对全血中T细胞亚群分类;3HTdR掺入法检测T淋巴细胞增殖。结果减毒活疫苗组在初免后诱导的体液和细胞免疫水平均低于灭活疫苗组,加强免疫后,与灭活疫苗相当。灭活疫苗组IFNγ的峰值出现时间较减毒活疫苗组晚,但水平较高。结论两种疫苗均可诱导体液和细胞免疫应答,减毒活疫苗进行加强免疫后可诱导更好的系统免疫应答。     

甲型肝炎病毒Js-4株经人二倍体细胞传代后的核苷酸序列分析

目的分析甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus,HAV)Js-4株经人二倍体细胞MRC-5传代后的核苷酸序列变异情况。方法将HAV Js-4株经Vero细胞适应14代获得的原始株Js-4-V14经人二倍体细胞MRC-5于35℃连续适应培养15代,取其中8个适应株(Js-4-M2、Js-4-M3、Js-4-M4、Js-4-M5、Js-4-M10、Js-4-M12、Js-4-M14、Js-4-M15)及原始株,提取病毒基因组RNA,通过RT-PCR扩增病毒全基因组,采用生物信息学软件DNAstar Lasergene 7进行序列分析。结果 8个适应株全基因组与Js-4-V14株的核苷酸序列同源性在99.8%～100.0%之间;第5代适应株在5′-NCR(101～200 bp)发生较大变异,表现为105～157 bp缺失,之后该突变稳定遗传;第10、12、14、15代适应株在2A(3 012～3 210 bp)区段3 122位点发生点突变;8个适应株和Js-4-V14毒株与野毒株HM175为同一基因亚型,均为IB型;9个毒株的主要抗原位点与野生株HM175完全一致。结论 HAV Js-4-V14株在MRC-5细胞传代适应过程中,主要抗原位点未发生突变,其与细胞适应性和病毒增殖有关的基因在传代早期已经变异,传代后期这些变异保持相对稳定。     

甲型肝炎病毒恒河猴模型的评估

目的　对国产恒河猴作为甲型肝炎病毒 (HAV)的动物模型做出全面评估。方法　用HAV野型株和H2株减毒HAV感染恒河猴 ,检测分析猴体的各种反应。结果　 14只恒河猴经 4株野型病毒感染后 ,全部血清抗体阳转 ,效价为 1∶2～ 1∶12 80 ,13只猴 ( 92 .9% )的血清酶异常升高和粪便排毒 ,2只猴 ( 14 .3% )有肝脏组织病理学极轻度改变 ;35 2只恒河猴分组接种 6 8批H2株及其子代病毒后 ,血清抗体阳转率为 99.7% ,血清酶异常升高率为2 .8% ,粪便排毒率为 5 8.3% ( 14 / 2 4 ) ,无肝脏组织病理学变化。结论　国产恒河猴是HAV的敏感动物 ,其ALT等血清酶指标能有效反映HAV的强毒或弱毒性质 ,可作为实验动物用于监测甲肝减毒活疫苗株的残余毒力     

纯化甲型肝炎灭活疫苗接种普通狨猴的安全性及免疫原性

目的观察纯化甲型肝炎灭活疫苗(Vero细胞)接种普通狨猴的安全性和免疫原性。方法将800EU/0.5ml和1600EU/ml两个剂量的纯化甲肝灭活疫苗(JS-4株)与进口疫苗(50U/ml)分别接种普通狨猴各2只,进行安全性和免疫原性检测,并进行强毒(JS-12株)攻击保护试验及毒力试验。结果接种疫苗后72h,各组狨猴均未发生局部及全身反应;有特异性抗-HAV产生;肝脏血清酶活性均有一过性升高,未见肝脏病理改变;并均能抵抗甲肝病毒强毒株(JS-12)的攻击;JS-4毒株采用106.67CCID50/ml剂量接种狨猴后未见毒力反应,但产生了73000mIU/ml的高水平抗体;而JS-12毒株接种狨猴后,狨猴出现肝脏血清酶活性升高和肝组织病理学改变。结论纯化甲型肝炎灭活疫苗具有良好的安全性和免疫原性。