Botrytis cinerea蛋白磷酸酶的分离纯化及酶学性质

[目的]植物真菌病害灰霉病是由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)侵染引起,它在世界范围内造成了严重的经济损失.B.cinerea易对化学药剂产生抗性,寻找更多对灰霉病有特效的生物农药是目前急需解决的难题.鉴于顺丁烯二酸酐类化合物良好的生物活性,研究此类化合物对蛋白磷酸酶的抑制效果.[方法]将发酵优化后的B.cinerea菌体经超声破碎、硫酸铵分级盐析、透析浓缩、DEAE-Sepharase离子交换层析等步骤分离纯化,并以SDS-PAGE验证酶纯度.考察所得纯酶的酶学性质,研究顺丁烯二酸酐类化合物对B.cinerea蛋白磷酸酶的抑制作用.[结果]经分离纯化后,该酶SDS-PAGE为单一条带,提纯倍数达30.79倍,酶活回收率为39.26％.酶学特性研究结果表明其最适反应pH值为4.0,最适反应温度为37℃.该酶在pH值3.0～6.0,50℃以下内稳定.考察金属离子对B.cinerea蛋白磷酸酶酶活的影响,发现Mg2+、Fe2+、Ca2+、Ba2+能提高该酶活性,Zn2+、Cu2+、Mn2+对酶活有抑制作用.以p -NPP为底物的酶动力学参数Vmax和Km分别为12.71 mmol/(L·min)与12.84 mmol/L.4种顺丁烯二酸酐类化合物对B.cinerea蛋白磷酸酶的抑制作用由大到小排名为苯基马来酸酐、4,5-二氯邻苯二甲酸酐、二甲基马来酸酐、顺丁烯二酸酐.[结论]此酶分离纯化步骤少,减少了酶活损失.以纯化的蛋白磷酸酶为靶标,顺丁烯二酸酐类化合物对酶活抑制效果良好,可研究抑制灰霉病机理及作为生物源农药开发.