硝普钠抑制K562 细胞增殖并诱导细胞凋亡的实验研究

目的: 观察外源性一氧化氮(NO) 供体硝普钠对K562 细胞增殖抑制及诱导细胞凋亡作用。方法: 将不同浓度的硝普钠与K562 细胞在体外培养, 观察其作用时间效应和剂量效应;用活细胞计数、MTT 法观察硝普钠对K562 细胞增殖的抑制作用;用DNA凝胶电泳、DNA 含量及细胞周期分析、Annexin-V/PI双标记和DNA 片段原位末端标记法等分析细胞凋亡。同时设高铁氰化钾(PFC) 对照组和空白对照组。结果: NO 能抑制K562 细胞生长, 并在一定的剂量范围内呈现作用时间和剂量的量效关系, 大部分细胞阻滞于G₀/G₁ 期;K562 细胞与硝普钠作用后出现典型的细胞形态改变, DNA 片断化, 亚G₁ 峰检出并显著增加, Annexin V/PI 和DNA 片段原位末端标记表达增加等均证实NO 能诱导K562 细胞凋亡。而对照组并无此类变化。结论: NO 通过阻滞G₀/G₁期细胞显著抑制K562 细胞的增殖, 并有很强的致凋亡作用。     

连续荧光监测法测定蛋白酶体活性及其在筛选蛋白酶体抑制剂中的应用

目的: 建立用连续荧光监测法测定蛋白酶体活性的方法, 研究其在筛选蛋白酶体抑制剂中的应用价值。方法: 用特异性荧光多肽底物 Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Suc-LLVT-AMC) 、Z-Val-Val-Arg-AMC(ZVVA-AMC) 、Z-Leu-Leu-Glu-βNA(ZLLG-βNA) , 分别测定蛋白酶体的糜凝乳蛋白酶样(chy-motrypsin-like, CT-L) 、胰蛋白酶样(trypsin-like, T-L)和肽基谷氨酰肽水解酶样(PGPH-like, PGPH-L) 活性, 对测定条件优化, 并进行方法学评价 。用该法测定了硼替佐米(PS-341) 和四嗪二甲酰胺(ZG-DHu-1) 对纯20S 蛋白酶体和 B16、Namalwa 细胞蛋白酶体提取物抑制作用。结果: 连续荧光监测法测定蛋白酶体活性的最适 pH 为 8.2;0.3 g/L SDS仅对 CT-L 活性有激活作用;CT-L 、T-L 、PGPH-L 的K m 分别为 3.55、4.12、4.88 μmol/L;酶反应进程曲线的线性期达 20 min;线性范围为测定纯 20S蛋白 酶 体 时, 其 蛋 白 浓 度 分 别 达 100、120、100 μg/L, 测定 B16 细胞蛋白酶体提取物时, 其蛋白浓度均达 200 mg/L ;精密度的批内 CV 为(2.25~ 5.78) %, 批间 CV 在(3.75~ 8.42) %。用该法测定了 PS-341 对 20S 蛋白酶体 CT-L 、T-L 、PGPH-L的 抑 制 活 性, 其 IC 50 分 别 为 12.36、 12.42、24.40 nmol/L ;测定 ZGDHu-1 对 20S 蛋白酶体抑制活性, IC 50 分别为 2.24、0.92、0.51 μmol/L 。结论: 连续荧光监测法测定蛋白酶体活性为快速、有效、大规模筛选蛋白体抑制剂类药物提供了一个技术平台, 也为临床上应用蛋白酶体抑制剂治疗提供了一个有用的检测指标。