Tollip体外转染HepG2215细胞对HBsAg和HBeAg分泌的影响及其机制

目的探讨Tollip转染人肝癌细胞系HepG2215细胞对HBsAg和HBeAg分泌的影响及其机制,为乙型肝炎的治疗寻找新的靶点。方法含HA标签的重组表达质粒pCMV-HA-Tollip经EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定后,采用脂质体LipofectamineTM2000转染HepG2215细胞,共设4个转染组:脂质体转染对照组(15μl脂质体)、空质粒转染对照组(6μg空质粒、15μl脂质体)、空质粒重组质粒共转染组(3μg空质粒、3μg pCMV-HA-Tollip、15μl脂质体)及重组质粒转染组(6μgpCMV-HA-Tollip、15μl脂质体),转染48 h后,收集细胞,经Western blot检测AKT、p-AKT、NF-κB以及HA标签蛋白的表达;收集上清,ELISA法检测HBsAg和HBeAg的水平。结果重组质粒pCMV-HA-Tollip经双酶切鉴定构建正确。空质粒重组质粒共转染组和重组质粒转染组均有HA标签蛋白的表达,而脂质体转染对照组和空质粒转染对照组无HA标签蛋白表达;与空质粒转染对照组比较,空质粒重组质粒共转染组和重组质粒转染组中NF-κB和p-AKT蛋白的表达明显降低(P<0.01),而AKT蛋白的表达无明显变化(P>0.05);空质粒重组质粒共转染组和重组质粒转染组细胞上清中HBsAg和HBeAg的含量明显低于空质粒转染对照组(P<0.01),对HBsAg的抑制率分别为24%和41%,对HBeAg的抑制率分别为13%和31%。结论 pCMV-HA-Tollip重组质粒在HepG2215细胞中能有效抑制HBsAg和HBeAg的分泌,其机制可能与抑制AKT的磷酸化和下调NF-κB的表达有关。     

维持静息细胞周期状态的小鼠肝细胞的分离纯化和原代培养

目的建立维持正常肝细胞静息细胞周期状态的小鼠肝细胞的分离纯化及原代培养方法。方法对传统小鼠肝细胞分离纯化的原位两步胶原酶灌流法进行改良,台盼蓝染色法计数细胞总数并鉴定肝细胞活率;用改良的WME培养基对C57BL/6小鼠肝细胞进行原代培养,经过碘酸雪夫氏染色(Periodic acid-Schiff stain,PAS)和全自动生化分析仪鉴定肝细胞的生物学特性及功能;Western blot法检测分离纯化后的小鼠肝细胞及原代培养24、48、72、96 h小鼠肝细胞的细胞周期蛋白p16、cyclin D1和cyclin A的表达水平。结果分离纯化后可从每只小鼠肝脏稳定获取(3～5)×107个肝细胞,细胞活率达(86.68±2.46)%;原代培养96 h内的小鼠肝细胞能保持合成糖原、白蛋白、尿素的功能;原代培养小鼠肝细胞中,细胞周期蛋白p16、cyclin D1和cyclin A的表达水平与分离纯化的小鼠肝细胞相比,差异无统计学意义(P>0.05),表明原代培养96 h内的小鼠肝细胞均能维持静息细胞周期状态。结论改良的分离纯化方法能稳定获得高产量、高活率的小鼠肝细胞;改良后的原代培养方法可使肝细胞维持其特异性功能、分化特性及静息细胞周期状态。     

槲皮素对结肠癌LOVO细胞增殖侵袭能力及癌胚抗原CEA表达的影响

目的: 研究槲皮素对结肠癌LOVO细胞增殖侵袭能力及癌胚抗原(CEA)表达的影响。方法: 采用MTT法检测不同浓度的槲皮素对LOVO细胞增殖能力的影响;内皮细胞粘附实验和小室侵袭实验检测槲皮素对LOVO细胞侵袭能力的影响;细胞免疫荧光、WB及RT-PCR检测槲皮素对LOVO细胞癌胚抗原CEA表达的影响。结果: 槲皮素能显著抑制LOVO细胞的增殖,呈浓度剂量依赖关系,IC₅₀约为 40 μmol/L;增强LOVO细胞与内皮细胞间的粘附能力,减弱其侵袭能力;并能显著抑制CEA蛋白及mRNA的表达水平,且呈浓度剂量依赖关系。结论: 槲皮素对LOVO细胞的增殖侵袭能力具有抑制作用,并能抑制CEA的表达。