液质联用技术中不同蛋白质鉴定策略的比较

在常用的多维液相色谱-质谱联用技术中,采取延长梯度洗脱时间、进行重复实验、采用质谱分段扫描等多种方法,提高对蛋白质的鉴定效率。为了系统评价这些方法在复杂生物样本分析中的效果,应用酵母的蛋白提取物作为样本,在LCQ质谱仪上进行一系列的比较实验。结果表明,在一定范围内,随着梯度时间的延长,被鉴定的非冗余肽段（unique peptide）数量显著增加,相对应的蛋白质簇（group protein）数量也随之增加。同样,进行重复实验和采用质谱分段扫描的方法均能提高蛋白鉴定的覆盖率,而采用质谱分段扫描的策略具有更为显著的效果,因此在规模化蛋白质组分析中,应当选择更为合适的、互补的研究策略以提高结果的完整性。     

质谱多反应监测技术（MRM）及其在蛋白质细胞器定位与定量研究中的应用

肝脏中的蛋白质只有处于特定的亚细胞中才能发挥其功能。研究特定蛋白质的亚细胞定位对于肝脏功能研究有重要意义[1]。对于多定位的蛋白质,确定其在不同细胞器中量的变化,也是肝脏蛋白表达谱研究的重要内容之一。目前,蛋白亚细胞定位分析方法主要包括实验方法和理论预测方法两大类。其中实验方法主要有绿色荧光蛋白（GFP）-激光共聚焦显微镜法、免疫电镜胶体金标记法、差速离心-免疫印迹法等。理论预测方法主要根据蛋白质的氨基酸组成、氨基酸对组成以及位置特异性打分矩阵等分类特征,采用模糊k近邻、支持向量机及分组重量编码法等方法进行理论预测。实验方法不仅分析通量低,还需要特异的抗体,并且在定位的同时难以实现定量分析。对于不同的理论预测方法而言,往往会得出不同的结论,准确度差。因而需要建立一种可以实现通量化、准确地进行蛋白亚细胞定位及定量分析的方法。 近年来,质谱多反应监测技术（MRM）在蛋白质定量分析方面的应用越来越广泛^[2]。该技术通过特异性的检测预先设置的母离子和子离子,在母离子和子离子两个水平排除其它离子的检测干扰, 从而增强检测的特异性。同时结合同位素稀释技术可以同时实现对多种目标蛋白质的绝对定量。由于该技术采用特异性检测预设的母子离子对的方法,从而保证了检测的重现性。而依据特定子离子和相应的同位素标记子离子对峰面积进行绝对定量的方法保证了定量的可靠性。同时可以批量化同时进行多个蛋白质的亚细胞定量及定位分析。因而本研究利用MRM技术,用于目标蛋白在肝脏细胞器中定位及定量分析研究。 鉴于本研究样品采用蔗糖密度梯度离心法制备,首先对细胞器样品的分离效果进行评价。选用文献报道^[3]的正向和反向免疫评价抗体蛋白,包括线粒体Marker蛋白COX4、VDAC和Cytc,细胞核Marker蛋白Lamin B,质膜Marker蛋白Na＋K＋-ATPase等。利用MRM技术分析蛋白在不同细胞器样品中的含量,从而对细胞器样品纯度进行评价。同时考察方法的灵敏度,重现性以及动态范围。 在确定了细胞器样品纯度的基础上,利用MRM质谱技术对选定的部分目标蛋白进行了定位分析。根据这些蛋白在不同细胞器样品中的含量,判断其在不同细胞器样品中的定位。并选择其中一些蛋白进行GFP-激光共聚焦显微镜分析,与基于MRM技术的定位分析结果进行对比验证。     

胍基化修饰结合稀土金属标记应用于蛋白质相对定量研究

稀土金属元素标记技术利用双功能试剂二乙三胺五乙酸双酸酐(DTPA双酸酐)将稀土金属元素和目标肽段连接起来作为质量标签,结合基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析实现蛋白质的相对定量研究。为进一步提高标记效率,本研究对反应体系温度、pH值、反应时间和金属标签过量倍数等进行优化,并结合胍基化修饰技术封闭蛋白质酶切肽段中的侧链ε-氨基,使标记反应只发生在末端氨基,提高标记选择性。标准蛋白质实验结果表明,所有酶切肽段胍基化反应效率均大于95%,且胍基化修饰反应对金属标记效率没有影响。对于选定的7个标准蛋白质而言,每个蛋白质都至少有3个肽段可以得到良好的标记结果。对于离子抑制效应带来的干扰,可通过标准曲线进行校正,结果表明,当两种金属离子浓度比小于6时,该效应对蛋白质相对定量没有影响。胍基化修饰结合稀土金属标记方法不仅能在肽段水平实现相对定量,而且能在蛋白质水平实现相对定量。     

基质辅助激光解析电离质谱靶上样

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术已成为目前蛋白质组学研究中的经典技术。在该技术的成功应用过程中,合适的样品前处理方法起着首要和关键的作用。只有将合适的样品前处理方法与合适的有机基质结合起来,才能成功实现对多肽和蛋白质等生物大分子的准确鉴定。随着质谱分析向高灵敏度、高准确度、高通量的方向发展,出现了许多新的,可直接在MALDI靶上前处理的方法,极大地简化了对生物样本的处理步骤,同时减少了样品的损失。特别是将一些纳米材料用于MALDI靶上进行样品的前处理,为样品前处理方法的研究开辟了广阔的应用前景。     

一种基于iSRM策略的蛋白质组质谱数据分析工具

由于重复性好、定量精度高,基于质谱的选择反应监测（SRM）技术在蛋白质定量分析中的应用越来越广泛。智能选择反应监测（iSRM）是一种新型的SRM实验策略。针对该策略产生的质谱数据,开发了一个肽段定量信息提取工具--iSQuant。该工具使用MATLAB脚本语言编写,简便易用。利用重复实验数据和标准实验数据对iSQuant的性能评估表明,iSQuant具有优越的可重复性能,定量结果和理论丰度线性度很高。