卡式瓶多剂量重组人干扰素α2b注射液与冻干制剂的比对研究及优势分析

目的通过剂型比对探讨卡式瓶多剂量重组人干扰素α2b注射液的剂型优势。方法将长春生物制品研究所有限责任公司在研卡式瓶多剂量重组人干扰素α2b注射液与同公司市售注射用重组人干扰素α2b各3批,同时置(25±2)℃避光条件下储存,0、1、2、3和6个月取样,亲和层析前处理浓缩后样品,分别进行非还原型SDSPAGE、SEC-HPLC、质谱肽图、质谱二硫键分析,比对两种剂型中蛋白聚合、降解、修饰产物种类及变化趋势;未经处理样品直接进行生物学活性检测,比对两种剂型有效性指标的变化趋势。结果 SDS-PAGE和SEC-HPLC分析结果相符,两种剂型在加速比对研究周期内均可见蛋白二聚体产生,冻干制剂可见多种蛋白多聚体产生,液体制剂仅见单一种类的蛋白多聚体产生,冻干制剂的电泳纯度和色谱纯度下降趋势较液体制剂明显;质谱分析结果显示,两种剂型均产生了乙酰化修饰产物、氧化修饰产物和二硫键错配产物,两种剂型内各种修饰产物的变化趋势趋于一致;两种剂型生物学活性无明显下降趋势,稳定程度相似。结论长春生物制品研究所有限责任公司卡式瓶多剂量重组人干扰素α2b注射液(25±2)℃存放6个月内聚合产物少,蛋白纯度下降速度慢...     

HEV ORF2截短融合蛋白的原核表达及其免疫原性

目的原核表达3型戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)第2个开放阅读框(open reading frame 2,ORF2)截短融合蛋白(HEV3-179-Fe),并检测其免疫原性。方法分别扩增HEV3-179和Fe蛋白基因片段,经Overlap PCR法连接并扩增,克隆至载体pET-28a,构建重组表达质粒pET-28a-HEV179-Fe,将其转化感受态E. coli BL21(DE3),取阳性菌株,IPTG诱导表达融合蛋白HEV3-179-Fe,进行10%SDS-PAGE分析。目的蛋白经镍离子金属鳌合亲和层析纯化后,加入硫酸铵进行病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)重构,置电镜下观察。HEV3-179-Fe蛋白VLPs与氢氧化铝佐剂吸附后免疫小鼠,ELISA法测定效价,以评价HEV ORF2截短融合蛋白的免疫原性。结果重组表达质粒pET-28a-HEV3-179-Fe构建正确。目的蛋白HEV3-179-Fe相对分子质量约40 000,主要以包涵体形式存在,表达量均达35%以上,纯度约95%,可与鼠抗HEV 3多抗发生特异性反应。硫酸...     

蜱传脑炎病毒非结构蛋白1的原核表达、纯化及应用

目的 原核表达、纯化蜱传脑炎病毒（tick-borne encephalitis virus,TBEV）非结构蛋白1(non-structural protein 1,NS1),并评价其在蜱传脑炎（tick-borne encephalitis,TBE）临床诊断中的应用价值。方法 根据GenBank登录的TBEV“森张”株NS1基因序列设计引物,PCR扩增TBEV NS1基因,克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-NS1,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经GST bestarose 4FF亲和层析纯化后,Western blot检测其反应原性;以重组NS1蛋白为固相抗原,采用间接ELISA法检测临床血清。结果 重组表达质粒pGEX-4T-1-NS1经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约65 000,表达量为22.1%,主要以包涵体形式存在;纯化蛋白纯度达93%以上,与TBEV全病毒感染小鼠血清具有良好的反应原性。采用NS1作为包被抗原的间接ELISA法检测临床血清,特异性为95%,敏感度为10...     

重组戊型肝炎病毒抗原ELISA检测方法的建立

目的建立重组戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法,用于HE疫苗中HEV抗原含量的检测。方法以重组HEV病毒样颗粒作为免疫原,免疫母鸡,制备抗HEV-IgY多克隆抗体,纯化后作为包被抗体,HRP标记的抗HEV单克隆抗体作为检测抗体,建立HEV抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法,并对其进行验证。用建立的方法检测3批HE疫苗成品的HEV抗原含量,计算HEV抗原对氢氧化铝的吸附率。结果建立的ELISA方法线性范围为2～128 ng/ml,最低定量限为2 ng/ml;该方法检测冻干甲肝减毒活疫苗、重组人白介素-2(IL-2)、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、人血白蛋白、小牛血清及健康人血清均无交叉反应;该方法检测3个浓度的HEV抗原内部参考品的回收率在95.13%～104.50%之间,试验内及试验间变异系数均<15%;包被抗HEV-IgY的酶标板于37℃放置5 d,其检测HEV抗原内部参考品的A450值及敏感性均未发生显著变化;3批HE疫苗成品中HEV抗原对氢氧化铝的吸附率均大于95%,符合相关质控要求。结论已成功建立了HEV抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法,可用于HEV抗原含量的检测。     

森林脑炎病毒单克隆抗体的研制及抗原定量双抗体夹心ELISA检测方法的建立和应用

目的 制备森林脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,TBEV)单克隆抗体,并建立TBEV抗原定量双抗体夹心ELISA检测方法,初步应用于疫苗生产过程中TBEV抗原含量监测.方法 以TBEV"森张"株灭活纯化全病毒作为免疫原免疫BALB/c小鼠,制备小鼠单抗杂交瘤及腹水抗体,纯化后鉴定单抗...     

狂犬病病毒抗原定量双抗体夹心ELISA检测方法的建立及应用

目的建立狂犬病病毒(Rabies virμs,RV)抗原定量双抗体夹心ELISA检测方法,以应用于疫苗生产过程中RV含量的监测。方法将RV aGV株纯化抗原经腹腔注射免疫BALB/c小鼠,制备抗RV单克隆抗体,纯化后以HRP进行标记,建立双抗体夹心ELISA检测方法。以狂犬病疫苗(效力检定用)国家标准品为定量标准,建立剂量-反应曲线,确定该方法的灵敏度,并对该方法的专属性、精密性及适用性进行验证。结果制备了2株针对不同抗原位点的单克隆抗体1E9和2H1,间接ELISA法测定腹水效价为1∶105～1∶107,纯化后蛋白含量分别为10.285和7.64 mg/ml。建立的ELISA法对RV抗原的最低检出限为1.03 mIU/ml,标准曲线的最佳线性范围为1.03～66 mIU/ml,相关系数为0.991 9。该方法对检测过程中可能遇到的杂质和添加物(人血清白蛋白、牛血清、Vero细胞培养上清)的检测结果均为阴性;检测3个浓度(20、12.50和3.13 mIU/ml)狂犬病疫苗(效力检定用)国家标准品的试验内和试验间变异系数的平均值分别为7.78%和14.0%;用该方法检测不同毒株、不同细胞生产的狂犬病疫苗的RV抗原含量的平均值在0.67～4.86 IU/ml之间。结论成功建立了RV抗原定量双抗体夹心ELISA检测方法,可对来自不同毒株、不同细胞的狂犬病疫苗的RV抗原进行快速定量检测,为疫苗生产中的质量控制提供了简便的监测手段。     

戊型肝炎病毒重组蛋白P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒的制备

目的制备戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)重组蛋白P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒。方法以4型HEV ORF2重组蛋白P179免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株,有限稀释法进行克隆化培养,制备腹水,并对杂交瘤细胞进行染色体计数,鉴定单抗亚类及特异性、并检测稳定性;经SDS-PAGE分析抗体纯度,以兔抗179抗原多抗作为包被抗体,HRP标记P179单抗作为酶标抗体,建立双抗体夹心ELISA法,制备试剂盒,并进行最佳线性范围测定、准确性、精密性和稳定性验证。结果获得4株能稳定分泌抗P179抗原单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为3A10、3F8、4E9和5G6,腹水抗体效价分别为1∶10-7、1∶10-6、1∶10-6和1∶10-7,染色体数分别为96、98、101和99条;亚类分别为IgG2a、IgG2a、IgG1和IgG2b;4株单抗连续传代3个月,液氮冻存1年抗体效价未发生变化;制备的试剂盒有良好的线性(R2>0.950 0)、准确性、精密性,试验内变异系数为4.17%～6.26%,回收率在87.9%～114.8%之间,试验间变异系数为5.82%～8.01%,回收率在90.8%～108.9%之间;于37℃及4℃放置3 d,仍具有良好的稳定性。结论成功制备了戊型肝炎病毒P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒,可用于戊型肝炎疫苗生产中定量检测疫苗抗原。     

单克隆抗体糖基化修饰的研究现状及进展

糖基化是经酶定向控制下,在蛋白质或脂质特定位点附加寡糖链的共翻译和翻译后重要的修饰过程,发生于高尔基体和内质网。糖基化修饰是单克隆抗体药物结构形成、功能发挥及药代动力学等生物学特性的重要影响因素。糖型通过影响单克隆抗体的结构而对药物的半衰期、效应功能等产生影响。在特定的细胞表达系统中,不同的细胞培养工艺参数对糖基化异质性产生影响。本文就糖型结构异质性对抗体效应功能的影响、细胞培养条件对抗体糖基化的作用以及糖基化研究技术的现状作一综述。     

某单位锅炉增容改造环境影响评价

某高校因招生规模不断扩大,致使供热能力严重不足。在统计计算和技术经济比较的基础上,提出在原址增加2台2t型煤锅炉和部分辅助设备的增容改造方案。针对改造方案,结合太原市和国家锅炉污染物排放标准,以实际燃用煤种为基础对锅炉主要污染物烟尘及SO2的排放量和排放浓度进行了环境影响评价。评价结果表明,污染物排放符合国家环保要求,证明增容改造方案可行。     

MDCK宿主细胞残留蛋白多克隆抗体的制备、纯化及初步应用

目的 制备MDCK宿主细胞残留蛋白多克隆抗体,并进行纯化及初步应用,为进一步研制宿主细胞残留蛋白检测试剂盒奠定基础.方法 无血清悬浮培养MDCK细胞,采用不同方法(反复冻融、裂解液、超声)裂解细胞获得全细胞蛋白抗原.将抗原与弗氏佐剂乳化后经背部多点皮下免疫家兔,间接ELISA法检测血清抗体效价,当抗体效价≥1 × 10...