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目的:为实现人源溶血磷脂酶D(LysoPLD)的原核异源可溶性表达。方法:通过NCBI检索,确定人源LysoPLD基因序列(GenBank: L46720.1)。采用密码子优化后的序列,克隆至pET-28a表达载体中,采用共表达麦芽糖结合蛋白融合标签(MBP)和共表达促蛋白正确折叠分子伴侣触发因子Trigger factor(tig)两种方式提高LysoPLD蛋白在大肠杆菌中的异源可溶性表达,建立对应蛋白的纯化工艺包括离子柱纯化,硫酸铵盐析,疏水柱纯化,淀粉树脂柱(Amylose Resin)纯化,分离纯化获得的重组酶,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定蛋白纯度,以对羟基棕榈酸酯为底物对比两种蛋白的酶学性质。结果:成功构建载体pET28a-MBP-LysoPLD和pET28a-pTF16-LysoPLD,并获得工程菌BL21(DE3)-pET28a-MBP-LysoPLD和BL21(DE3)-pET28a-pTf16-LysoPLD。BL21(DE3)-pET28a-MBP-LysoPLD经0.6 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)低温诱导过夜可获得上清表达的MBP-LysoPLD蛋白;BL21(DE3)-pET28a-pTf16-LysoPLD在含有0.5 μg/mL L-Arabinose的LB培养基中培养,经0.1 mmol/L IPTG低温诱导表达,可获得可溶性表达的LysoPLD蛋白,经纯化,酶纯度可大于80%。以对羟基棕榈酸酯为底物,对比两种方法得到的蛋白的酶学性质,发现二者催化反应的最适温度、最适pH、最适Ca2+浓度、比酶活基本一致。结论:两种基因共表达方式都可实现人源LysoPLD的在大肠杆菌中的可溶性表达,且酶学性质基本相同。 相似文献
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注浆堵水技术在盲斜井施工中的应用 总被引:1,自引:0,他引:1
通过福建省鑫阳矿业有限公司盲斜井施工工程的防治水实践,阐述了盲斜井工作面注浆堵水的施工工艺和注浆参数的选择与应用.实践表明,经过注浆处理的破碎带高承压水地段,涌水量已降至5m3/h. 相似文献
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1 高层建筑地下汽车库通风与排烟系统的形式《汽车库、修车库、停车库设计防火规范》GB5 0 0 6 7- 97(以下简称“车库规”)规定的防烟分区较《高层民用建筑设计防火规范》(以下简称“高规”)有所扩大 ,但排烟量与平时排风量相差无几 ,基本解决了平时排风与火灾排烟合用系统之间存在的不少难以协调的问题。笔者认为 ,在“车库规”指导下 ,地下汽车库通风与排烟系统主要形式可以归纳 (这里仅从风机组合形式上划分 )如下 :1.1 平时排风和火灾排烟合用一台风机防烟分区内 (通常在 10 0 0 m2 以内 )设风机一台 ,平时排风与火灾排烟均运行 ,系… 相似文献
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首先从Pyrococcus horikoshii中克隆出编码热稳定性的内切纤维素酶基因,以载体pet21a为表达质粒,
构建重组质粒pet21a-1171,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)plys中进行表达,目的基因得到明显的可溶性表达,通
过加热变性处理和离心后,重组酶纯度达到80%以上,随后对加热处理后的粗酶液进行简单酶活测定,结果表明,
最适反应温度为95℃,与国外文献报道相一致,嗜热内切-1,4-β-葡聚糖酶成功得到重组可溶性表达。 相似文献
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针对源区河流氮素时空分布规律,选择位于安徽省休宁县境内上溪口地区新安江源头段作为试验研究对象,通过野外采样、水质监测和统计分析方法,研究试验区域洪水前后各项监测指标的时空分布特征及其影响因素,揭示洪水对新安江源区河流氮素的影响。结果表明:流域水体总氮浓度沿水流路径逐渐增加;洪水后总氮、氨氮和硝氮浓度比洪水前均有所增大,洪水期雨水对流域的氮素进行了“冲刷”;相关性分析表明洪水前硝氮和总氮受植被影响较大,洪水后硝氮与汇水面积相关,总氮浓度受高程、坡度和地质等因素影响;所构建的预测模型能够较好地预测洪水前硝氮和总氮以及洪水后氨氮和硝氮的分布。 相似文献