基于实时荧光聚合酶链式反应快速检测食源性大肠埃希氏菌O157:H7

目的 建立一种快速、灵敏、特异、高效的食源性大肠埃希氏菌O157:H7型实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)检测方法。方法 针对大肠埃希氏菌O157:H7型的O抗原特异基因rfbE保守区域设计特异性引物和探针, 合成基因片段绘制标准曲线, 在菌液基因组DNA和质粒双层面调试优化以完成方法的初步建立。其后, 对该方法的特异性、敏感性、重复性等进行全面的质量评估验证。结果 该方法特异性100%; 基因组DNA检测敏感性为7.11×102 fg/μL; 纯培养物水平检测敏感性为1.0×102 CFU/mL; 重复性变异系数在0.10%~1.00%之间; 标准曲线相关系数r2为0.9994。结论 成功建立了一种性能良好的大肠埃希氏菌O157:H7型实时荧光探针PCR快速检测方法, 该方法具有灵敏度高、特异性强、扩增时间短, 仅为35 min的特点, 可用于疑似大肠埃希氏菌O157:H7型污染样品的快速诊断检测。     

荧光免疫定量法即时检测谷物中黄曲霉毒素B1

目的 基于时间分辨荧光免疫层析技术,研制快速定量检测试纸条,用于粮谷物中黄曲霉毒素B1的检测。方法 以荧光微球为标记物,采用DNP独立质控体系和竞争法检测原理,构建了粮谷物中黄曲霉毒素B1荧光免疫定量即时检测（point-of-care testing ,POCT）方法。评价其准确度、重复性、特异性、与仪器确证方法符合度。结果 该方法最适条件为：pH7.8硼酸盐（BB）活化,pH7.5磷酸盐（PB）偶联,微球抗体质量比为5:4,抗原抗体质量比为50:1。检测限在0.299 ng/g -0.997 ng/g之间,定量限在0.544 ng/g -2.663 ng/g。代表性样本准确度为92.2%-111%,重复性为3.2%-7.5%。除与黄曲霉毒素B2有交叉反应（6.1%）,与其他类似物无（<0.1%）。该法检测结果与仪器确证法一致性好,在-12.5%—15.9%之间。结论 提供了一种准确、快速、定量、灵敏、便捷、适合现场检测粮谷物中黄曲霉毒素B1的时间分辨荧光免疫检测试纸条。     

谷物中玉米赤霉烯酮高灵敏时间分辨荧光免疫层析定量法的建立

建立了一种快速检测谷物中玉米赤霉烯酮的时间分辨免疫层析定量检测方法。对荧光微球与抗体制备过程、抗原抗体反应比例、样本前处理过程等实验条件进行优化，在最佳实验条件下，评价试纸条的检测限、准确度、重复性、特异性及稳定性。试纸条最佳研制条件：活化缓冲液为pH5.0 MES,标记缓冲液为pH7.2 HEPES,EDC用量为100μg,抗体标记量为100μg,膜T线0.6 mg/ml, C线0.25 mg/ml包被，微球偶联物稀释6倍。确定60%甲醇水和样本按质量体积比1∶5混匀提取时间5 min。通过Logistic曲线四参数拟合，R²均为0.99,在5～200 ng/g范围内具有较好的线性关系，玉米、小麦、小米、大米样本的检出限分别为4.24、1.28、1.63、1.49 ng/g。回收率在82.00%～113%,变异系数均小于15%。与其他真菌毒素的交叉反应率均小于1%,37℃放置21 d基本稳定。选择20份样本与仪器确证方法比较，结果一致性好。所制备的试纸条具有较好准确性、重复性、特异性及热稳定性，该方法操作简单、快速，结果准确、可视化，适合于大批量样本的快速筛查。