马立克病病毒中meq基因对CEF细胞chTERT mRNA转录水平的影响

目的研究鸡马立克病病毒(MDV)meq基因对鸡胚成纤维细胞(CEF)的端粒酶催化亚单位基因(chTERT) mRNA转录水平的影响,并探讨meq基因与端粒酶活性的关系。方法构建重组载体pcDNA-meq,转染CEF细胞,利用Taq- Man探针,经实时荧光定量RT-PCR检测meq基因对CEF细胞chTERT mRNA转录水平的影响,并用TRAP法测定端粒酶活性。结果meq基因能激活CEF细胞中chTERT mRNA的转录,在48h的转录水平是72h的16倍,端粒酶活性在转染后48h是转染后72h的12倍。结论meq基因可能是MDV基因组中的主要致瘤基因,可以在体外导入正常的CEF细胞中,激活端粒酶的活性。     

乳品中的酵母活菌数PMA-qPCR检测方法的建立及初步应用

本实验旨在对乳品中酵母菌活菌总数进行准确的定量检测,深入研究PMA处理乳品中酵母热损伤菌的最佳工作条件,去除热损伤死菌DNA的影响。针对从乳品中分离的三株酵母菌26S rDNA D1/D2区域序列设计引物Y3和Y4,运用实时荧定定量PCR进行序列扩增,以重组质粒pMD-18T-26S拷贝数对数与扩增循环数(Ct)值为坐标轴建立标准曲线,建立PMA-qPCR检测方法,并对实际样品中的酵母菌活菌富集后进行数量检测。PMA-qPCR法可达到国标规定的食品中酵母菌最高限量值1×10² CFU/mL的检测标准,对应Ct值为36.67±0.43,重复性良好,总耗时6~7 h,可对酵母菌数量进行准确和快速的定量分析,为乳品中腐败微生物的鉴定与监控提供有价值的借鉴。     

玉米赤霉烯酮间接竞争ELISA方法的建立

本研究以玉米面为例,建立了玉米赤霉烯酮间接竞争ELISA (ic-ELISA)方法.采用棋盘滴定法确定抗原和单抗的最佳工作浓度,并确定了抗原37℃包被1h、不封闭、酶催化底物作用时间15 min的反应条件进行检测.该方法的检测范围(IC20～IC80)为11 ～292 pg/mL,检测限(IC10)为6 pg/mL.玉...     

玉米中伏马毒素B1、B2间接竞争酶联免疫吸附方法的建立

基于伏马毒素B1(fumonisin B1,FB1)单克隆抗体建立了间接竞争酶联免疫吸附法(indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay,ic-ELISA),用于玉米中伏马毒素的初步筛查。该方法优化了抗原包被浓度和单抗体稀释倍数、抗原包被条件、酶标二抗稀释倍数、底物作用时间。结果显示,线性检测范围为1.41～54.2ng/m L,最低检测限为24.5μg/kg,实测玉米样品加标回收率为89.36%～108.54%。交叉反应结果显示,与伏马毒素B2(fumonisin B2,FB2)交叉反应率为129.88%,与其他真菌毒素交叉反应均小于10%,该ic-ELISA方法可对玉米样品中的FB1与FB2总量进行初筛。     

乳品中热带假丝酵母菌的双抗夹心ELISA快速检测方法

本研究用于乳品中热带假丝酵母菌的快速检测。采用热带假丝酵母菌超声破碎后的上清蛋白作为免疫原分别免疫新西兰大耳白兔和Hartley豚鼠,获得热带假丝酵母菌的多克隆抗体。以兔抗体作为捕获抗体,豚鼠抗体作为检测抗体,通过矩阵法及正交分析建立乳品中热带假丝酵母菌快速、特异的双抗夹心ELISA检测方法。该方法检出限为98 ng/m L,板内变异系数小于2%,板间变异系数小于6%,特异性及重复性良好。实际样品检测中,通过对乳制品进行滤膜集菌并选择性增菌培养,超声后提取的蛋白上清应用本研究建立的双抗夹心ELISA检测方法,100 CFU/m L热带假丝酵母菌可在22 h内准确检测出阳性反应。      

重组免疫毒素IL-6_(T23)-PE38KDEL在大肠杆菌中自诱导表达条件的优化

目的优化重组免疫毒素IL-6(T23)-PE38KDEL在大肠杆菌中的自诱导表达条件,以提高菌体浓度及可溶性目的蛋白的表达量。方法采用摇瓶培养,利用单因素和正交试验对工程菌自诱导的培养条件(接种量、诱导时间、诱导温度、装瓶量)和培养基组分(有机氮源、无机氮源、碳源、有机酸)进行优化,检测菌体浓度、可溶性目的蛋白的表达量及质粒稳定性。结果确定最适自诱导培养条件为装瓶量20 ml/250 ml、接种量2%,28℃诱导25 h;最适自诱导培养基组分为:蛋白胨2%、酵母浸粉0.5%、Na2HPO425 mmol/L、KH2PO425 mmol/L、硫酸铵25 mmol/L、葡萄糖0.05%、甘露醇1%、乳糖0.6%、苹果酸钠20 mmol/L、MgSO40.5 mmol/L。此时可溶性目的蛋白的表达量和菌体浓度分别为LB培养基(IPTG诱导)的1.76和2.12倍,质粒稳定性由87%提高至98%。结论优化了重组免疫毒素IL-6(T23)-PE38KDEL在大肠杆菌中的自诱导表达条件,为其工业化生产奠定了基础,也为自诱导在其他重组蛋白药物生产中的应用提供了参考。     

抗大田软海绵酸单抗独特型抗体的制备及鉴定

目的:研制大田软海绵酸(okadaic acid,OA)单抗的独特型抗体并鉴定其模拟抗原特性,为建立无毒检测提供借鉴.方法:利用小鼠腹水法大量制备抗OA单抗,经辛酸饱和硫酸铵法纯化后用胃蛋白酶酶切制备F(ab')<,2>片段,免疫日本大耳白兔,取其血清,琼脂扩散法检测血清抗体与抗OA单抗反应活性,ELISA方法鉴定血清...     

鲜乳中常见污染细菌的分离与鉴定

对吉林省污染鲜乳的细菌进行分离鉴定,以分析本地区鲜乳污染情况,为建立针对性检测鲜乳中的污染细菌提供参考。采集吉林省部分地区奶牛养殖场及农户散养奶牛自产鲜乳,采用常规培养方法进行分离培养。用聚合酶链式反应(PCR)扩增细菌16S rDNA,对PCR产物测序、分析,与Genbank上已知的细菌16S rDNA序列对比同源性,交叉同源性较高的细菌进行生化实验加以补充鉴定。结果表明,分离并鉴定出吉林省污染鲜乳的常见细菌,为鲜乳在生产加工过程中有针对性的检测特异性细菌奠定了基础。     

抗神经性贝毒素PbTx-2单克隆抗体的制备及鉴定

研究采用混合酸酐法将神经性贝毒素PbTx-2与牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)偶联制备完全抗原。用免疫原PbTx-BSA免疫8周龄BALB/c小鼠,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,经过4次亚克隆获得一株可稳定分泌抗PbTx-2的杂交瘤细胞株4B5,间接ELISA法测得腹水效价为1:5.12×104,抗体亚类为IgM,亲和常数为2.32×107mol/L。     

海产品贝毒素大田软海绵酸ELISA及HPLC-MS/MS检测方法的研究

为了检测海产品贝毒大田软海绵酸,保障其食用安全,利用活泼酯法将小分子OA与载体蛋白偶联,免疫BALB/c小鼠,细胞融合技术建立分泌抗OA的杂交瘤细胞株,并对其各种特性进行分析;小鼠腹水法大量生产抗体,纯化后建立ELISA方法,同时建立OA的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS)检测法,并对部分市售海产品进行了实际检测,ELISA方法标准曲线为y=－34.212x+83.49,相关系数为0.9784,线性范围0.4～25μg/L,灵敏度0.18μg/L;HPLC-MS/MS检测方法标准曲线y=193.07x－780.6(Q1/Q3：m/z 827.4～m/z 723.5)和y=83.021x－335.6(Q1/Q3：m/z 827.4～m/z 809.5),R2 均为0.9991,线性范围10～800μg/L,灵敏度小于2μg/L,平均RSD为4.34%。在检测的实际样品中两种样品ELISA呈阳性反应,其中一种经过了HPLC-MS/MS的验证。所建立的ELISA及HPLC-MS检测方法均可用于海产品腹泻性贝毒OA限量标准检测,为进出口海产品OA标准方法的建立提供实验基础。