蜂毒肽在大肠杆菌中的高效融合表达与纯化

生物法制备蜂毒肽是实现大量制备蜂毒肽的关键技术。为实现蜂毒肽的高效表达,通过化学法合成含信号肽、前导肽和成熟肽的蜂毒肽基因promet和蜂毒肽成熟肽基因met,与麦芽糖结合蛋白基因mbp连接,克隆到载体pET15-b,构建重组质粒pET-MBP-MET和pET-MBP-proMET。重组质粒转化大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）,以0.1 mmol/L IPTG进行诱导,30 ℃下过夜诱导,融合蛋白MBP-MET、MBP-proMET在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达。两种目标蛋白质经Ni柱和Dextrin Sepharose HP两步亲和纯化,得到了纯度达90%以上的融合蛋白MBP-MET、MBP-proMET,培养1 L大肠杆菌菌液能制备约20 mg纯蛋白质。通过牛津杯抑菌实验发现,MBP-MET、MBP-proMET能明显抑制细菌生长,产生明显的抑菌圈,MBP-MET和MBP-proMET最低抑菌浓度（MIC）分别为100 μg/mL和140 μg/mL。本研究首次实现了蜂毒肽的高效表达,并进行了抑菌功能验证,为生物法制备蜂毒肽提供了高效、安全的合成途径。     

前导肽对 Aspergillus pseudoglaucus酸性蛋白酶App表达及功能的影响

从Aspergillus pseudoglaucus基因组中克隆酸性蛋白酶App基因,分别将其自身前导肽基因pro、来自Candida tropicalis的candidapepsin前导肽基因CP、Saccharomyces cerevisiae的proteinase A前导肽基因PP、Rhizomucor miehei的proteinase前导肽基因RP、Candida albicans的aspartic proteinase 2前导肽基因SP导入基因的5′端,获得含不同前导肽的App基因片段,于Escherichia coli中表达。SDS-PAGE结果显示,不加前导肽时,蛋白质不表达;酶活测定结果显示,加入自身前导肽时,蛋白质proApp在55℃、pH 2.8条件下有最大酶活质903 U/mg。而其他前导肽能使蛋白质表达但蛋白质无酶活。圆二色谱结果显示,前导肽能够改变蛋白质二级结构组成,使其无法正确折叠。乳蛋白水解结果显示,在55℃,pH 2.2条件下,proApp有最大水解活力252 U/mg。该研究表明特定前导肽对蛋白酶异源表达与水解功能的重要性,同时为酸性蛋白酶水解乳蛋白提供了良好的研究基础。