牛奶蛋白改性纤维免疫层析快速鉴定方法

建立了一种快速、简单、准确的牛奶蛋白改性纤维鉴定方法。使用ESI(Electron Spray Ionization)/TOF(Time of Flight)质谱对牛奶蛋白改性纤维胰蛋白酶解肽进行分析,确定了牛奶蛋白改性纤维特征肽段,使用该特征肽段制备得到特异性单克隆抗体;将酪蛋白包被于T线,建立了针对牛奶蛋白改性纤维的免疫层析快速鉴定方法。该方法以7M尿素为提取剂,检出限为氨基酸质量分数为1.00%的牛奶蛋白改性纤维(相当于混纺4.00%牛奶蛋白改性纤维的纱线),检测时间不超过20 min(含前处理)。该方法无需使用分析仪器,对常见的纤维没有非特异性识别,纤维的染色不会对检测结果造成干扰。     

基于酶联免疫分析的大豆蛋白复合纤维鉴定方法

不同蛋白来源的改性纤维成本差异较大,为区分纤维的蛋白来源,建立了一种简单、准确的大豆蛋白复合纤维鉴定方法。根据大豆蛋白现有的氨基酸序列和蛋白交联的位点设计一段特征肽半抗原,将该特征肽段偶联载体蛋白,免疫实验动物,并制备得到特异性单克隆抗体。将优化浓度的抗原包被于酶标版,抗体偶联辣根过氧化物酶,建立针对大豆蛋白复合纤维的酶联免疫吸附实验(ELISA)。该方法采用7M尿素作为提取剂,检出限为1. 8%氨基酸含量的大豆蛋白复合纤维,检测时间不超过70 min(含前处理)。该方法对常见的纤维无非特异性识别,纤维染色不会对检测结果造成干扰。     

过敏性哮喘模型小鼠肥大细胞的活化及细胞因子的变化

目的观察粉尘螨粗抗原建立的Bal b/c哮喘模型小鼠肥大细胞的活化及细胞因子的变化。方法将20只Bal b/c小鼠按随机数字表法分为2组：阴性对照组（A组,n=10）,使用100μL PBS处理;哮喘模型组（B组,n=10）,50μg粉尘螨粗抗原＋50μL明矾佐剂分别在第0、7和14d腹腔注射致敏1次,第28天再用50μg粉尘螨抗原滴鼻激发,每天1次,连续7次。末次激发24h测定气道高反应;48h处死小鼠进行眼球取血,进行肺泡灌洗并收集右肺的肺泡灌洗液（BALF）,无菌取肺HE染色病理观察、甲苯胺蓝染色观察肥大细胞脱颗粒,制取脾细胞及粉尘螨粗抗原刺激培养。采用ELISA法测定BALF和脾细胞培养上清IL-4、IL-10和IFN-γ以及血清IgE、组胺抗体含量。结果与A组相比：B组气道高反应性和肺部病理显著加重（P〈0.01）;BALF细胞总数和嗜酸粒细胞数显著增多（P〈0.01）;肥大细胞脱颗粒现象显著加重;血清抗原特异性IgE水平显著升高（P〈0.01）;BALF和脾细胞培养上清IL-4和IL-10水平显著升高（P〈0.05或P〈0.01）,IFN-γ水平显著降低（P〈0.01）;BALF和血清组胺水平显著升高（P〈0.05或P〈0.01）。结论过敏性哮喘模型中肥大细胞被活化。     

糖皮质激素广谱特异性单克隆抗体的制备及其ic-ELISA方法的建立

将氢化可的松半抗原HYD通过活化脂法与钥孔戚血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin,KLH）偶联获得氢化可的松完整抗原KLH-HYD,并对小鼠肌肉注射此抗原,使小鼠免疫;通过杂交瘤技术获得1 株能够稳定分泌氢化可的松的单克隆抗体细胞株HYD-C1,并通过腹水制备大量抗体。将氢化可的松半抗原HYD和地塞米松半抗原DEX通过活化脂法分别与卵清蛋白（ovalbumin,OVA）偶联作为包被原,建立糖皮质激素的间接竞争酶联免疫吸附检测（indirect competitive-enzyme linked immunosorbent assay,ic-ELISA）方法。结果：在同源包被情况下氢化可的松灵敏度为1.63 ng/mL,异源包被情况下灵敏度为0.24 ng/mL;在交叉抑制实验中,异源策略中的各糖皮质激素灵敏度均高于同源策略中的结果,异源策略条件下很好地覆盖了本研究中所检测的糖皮质激素,使该抗体具备良好的广谱特异性。在异源策略添加回收实验中平均添加回收率在77.5%～111.3%之间,落在合理范围内,满足检测需求。结论：成功制备出氢化可的松单克隆抗体,建立了同源和异源策略糖皮质激素检测方法,结果发现异源策略中糖皮质激素的灵敏度高于同源策略,并使该方法具有更好的广谱特异性。     

胶体金免疫层析法快速检测配方羊奶粉中的牛β-乳球蛋白

建立了一种可快速检测配方羊奶粉中牛β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-lg)的胶体金免疫层析检测方法。通过杂交瘤技术制备β-lg单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),半抑制浓度(50% inhibiting concentration,IC₅₀)为5.87 μg/mL。将胶体金标记的β-lg mAb包被于金标垫,β-lg和山羊抗小鼠IgG标记于硝酸纤维素膜(nitrocellulose membrane,NC膜)分别作为检测线(T线)和质控线(C线),开发了可检测β-lg的免疫层析试纸条。该试纸条对β-lg的检测限(limit of detection,LOD)值为50 μg/mL,与其他基质成分均未产生有效交叉反应,对全脂山羊乳粉中掺杂脱脂牛奶粉(nonfat skim milk,NFSM)、脱盐乳清粉(desalted whey powder,DWP)和乳清蛋白粉(whey protein powder,WPP)的LOD值分别为5%、5%和0.1%。运用该方法对9个市售配方羊奶粉进行分析,检测结果与商品化酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒一致。该方法前处理快速简单,5 min即可裸眼判定结果,可用于配方羊奶粉商品的现场快速检测。