实验室芽孢杆菌菌种库中高产蛋白酶、糖基转移酶菌株的测定与筛选

该研究以实验室前期构建的小型芽孢杆菌菌种库中的335株芽孢杆菌菌株为研究对象,通过测定其产蛋白酶和糖基转移酶的特性挖掘到蛋白酶缺陷菌株68株、产中性蛋白酶菌株185株、产碱性蛋白酶菌株217株和具较强蛋白分泌能力的菌株87株。经进一步筛选获得22株高产碱性蛋白酶菌株和12株高产中性蛋白酶菌株;另外,基于此菌株资源库,同时进行了产新型糖基转移酶的菌株筛选,以甜菊苷为底物,得到了13株底物转化率达50%以上的菌株,其中菌株BAP#和114#的转化产物分别被鉴定为莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷E。综上可见,实验室的芽孢杆菌菌株资源库虽然规模较小,但无论是对于常用工业酶制剂的开发,还是对于新型食品用酶的定向挖掘,都提供了丰富和多样的菌种资源,显示了很好的菌种筛选应用前景。     

植物乳杆菌CGMCC.5297产细菌素条件的优化及应用

用响应面法对植物乳杆菌CGMCC.5297生产细菌素的培养基进行了优化。通过Plackett-Burman设计和中心组合试验设计,植物乳杆菌CGMCC.5297代谢产细菌素的最佳培养条件为酵母粉5.09g/L,牛肉膏10.85g/L,葡萄糖55.34g/L。此时的细菌素上清与指示菌单核细胞增多性李斯特菌CVCC1595共培养4h后,指示菌OD600nm为0.001 73,效价为4499 IU/mL,提高了1.4倍。在最优发酵条件下获得的试验结果与模型预测值吻合,说明所建立的模型是切实可行的。将优化后的植物乳杆菌上清加入到自制酸奶中,发现此细菌素对酸奶具有良好的保鲜效果。     

甜蛋白Brazzein在毕赤酵母中的表达及应用

巴西甜蛋白(Brazzein)是分离自非洲西部野生植物Pentadiplandra brazzeana Baillon果实中的一种天然高倍甜味蛋白,具有较好的食品应用潜力。利用毕赤酵母GS115对巴西甜蛋白及蛋白二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)进行共表达,重组Brazzein在发酵液中分泌表达量为1 g/L。采用超滤-纳滤膜分离系统和冷冻干燥技术开发重组Brazzein的低成本制备工艺,并完成口感评价,甜度倍数为蔗糖的40倍。同时研究了重组Brazzein对常见致病菌和肠道益生菌的体外抑菌性能,结果表明,重组Brazzein对白念珠菌的最低抑菌质量浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)为15 mg/mL,对金黄色葡萄球菌的MIC值为7.5 mg/mL,对桧状青霉的MIC值为3.75 mg/mL,对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和粪肠球菌没有发现明显的抑菌效果。该研究为Brazzein在甜味剂方面的推广应用提供了理论研究基础。     

黑曲霉糖化酶基因的克隆及其在毕赤酵母X33中的表达

[目的]以毕赤酵母(Pichia pastoris)X33为宿主菌高效表达黑曲霉(Aspergillus niger)糖化酶,为进一步扩大糖化酶在工业上的应用奠定基础.[方法]利用RT-PCR技术,提取黑曲霉总RNA进行反转录,以得到的cDNA为模板,根据NCBI数据库中A.niger CBS513.88糖化酶的cDNA序列(glaA)设计引物,通过PCR扩增得到去除天然信号肽的糖化酶成熟肽编码基因glaAm,并将其克隆到pUC19载体中,序列分析表明,glaAm的开放阅读框由1 879个核苷酸组成,编码625个氨基酸.以此片段构建了pFLDα-glaAm重组表达载体,经Nsi I线性化后,电击转化毕赤酵母X-33.摇瓶培养中通过添加终浓度为0.5%的甲醇诱导糖化酶的分泌.[结果]SDS-PAGE和Starch-PAGE显示,糖化酶得到正确的分泌表达,且具有较高的生物活性,发酵上清液中酶活最高达到380.78 U/ml(发酵液).重组糖化酶的最适反应温度和最适pH分别为60～65℃和4.0,在pH 2.5～5.5范围内均保持90%以上的酶活力.该酶具有较高的热稳定性,pH 4.0条件下,该酶在50℃下稳定;60℃处理60 min,仍能保持90%以上的酶活力;65℃下的半衰期约为44 min.[结论]黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母X33中得到了异源高效表达.