聚丙烯腈膜固定化海藻糖合成酶的研究

以聚丙烯腈膜(PAN)为载体,采用吸附法固定化海藻糖合成酶粗酶液。通过单因素法探讨最佳固定化条件,并分析固定化酶酶学性质。结果表明,最佳固定化条件为:pH 7.6、30℃、加酶量0.1 mg/cm~2条件下震荡吸附3 h;该条件下制备的固定化酶最适反应条件为:温度40℃、pH 7.4、初始麦芽糖底物浓度200 g/L。与游离酶相比,固定化酶热稳定性提高10℃、酸碱稳定性由pH 6.6～7.4扩展至pH 5.4～8.0;反应达到平衡时,反应液中海藻糖含量为50.9%,副产物葡萄糖含量为9.1%,较游离酶降低6个百分点,在目前已报道的固定化海藻糖合成酶催化反应中副产物含量最低;在40℃、pH 7.4、麦芽糖底物浓度200 g/L条件下,重复使用累计72 h后,固定化酶活仍保留在初始酶活的64.4%。     

重组乳酸克鲁维酵母产磷脂酶A2发酵条件的优化

利用重组乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）GG799表达磷脂酶A2,对其产酶发酵条件进行研究。采用单因素试验和正交试验对培养基及培养条件进行优化,确定了重组菌产酶的最佳发酵条件。结果表明：最优培养基组成为葡萄糖30 g/L、酵母粉20 g/L、蛋白胨30 g/L、KH2PO4 3 g/L;最优培养条件为：发酵温度30 ℃、接种量2%（V/V）、初始pH?7.0、装液量90 mL/250 mL三角瓶、摇床转速220 r/min,在此条件下发酵培养,酶活力由（1.87±0.12）U提高到（5.35±0.27）U。     

Bacillus sp.CBB272脱枝酶的酶学性质

脱枝酶是淀粉加工过程中水解其1,6-糖苷键的水解酶,为淀粉彻底糖化所必需。作者从高温菌Bacillus sp.CBB272的培养液中,经过盐析、凝胶过滤层析、弱阴离子交换层析以及强阴离子交换层析联用的方法,纯化出一种新型脱枝酶。该酶在SDS-PAGE上的相对分子质量约为70 000,最适作用温度为70℃,最适作用pH为6.0。该酶在30~70℃、pH 4.5~9.0之间具有优良的稳定性。该酶在50℃和pH 6.0下水解支链淀粉的Km、Vmax分别为4.0324 mg/mL和0.1841 mg/(min.mL)。研究了不同金属离子对该酶活性和热稳定性的影响,发现Ca2+、Mg2+、Mn2+等金属离子对于该酶具有显著的激活效果,并且Ca2+对该酶的热稳定性具有很好的提升作用。     

嗜热放线菌海藻糖合成酶在地衣芽孢杆菌中的异源表达

海藻糖合成酶可将麦芽糖异构化为海藻糖,是海藻糖酶法生物转化的中心酶制剂。为了实现海藻糖合成酶在食品安全型表达宿主中高效生产,进而应用于食品级海藻糖的酶法合成,构建了革兰氏阳性菌重组表达质粒并转化入地衣芽孢杆菌。重组质粒携带了来自于嗜热放线菌Thermomonospora curvata海藻糖合成酶的编码基因,在地衣芽孢杆菌木糖异构酶启动子及其阻遏蛋白的介导下表达,胞内海藻糖合成酶发酵活力为12.1 U/m L。考察了不同培养条件对重组菌生长和产酶的影响,结果显示质量分数4%的麦芽糊精和质量分数0.4%的豆饼粉分别为产酶适宜的碳源和氮源;菌体培养10 h后加入终质量浓度为1 g/d L的诱导剂,于37℃诱导12 h后重组菌产酶最高达到23.7 U/m L。     

重组枯草芽孢杆菌分泌表达腺苷酸脱氨酶

目的：利用基因重组技术,构建腺苷酸脱氨酶高效表达的重组菌株。方法：以前期构建的产腺苷酸脱氨酶重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET28α-AMPD中来源于鼠灰链霉菌（Streptomyces murinus）目的基因为模板,设计特异性引物扩增腺苷酸脱氨酶基因,亚克隆至游离型表达载体pHY-WZX,转化枯草芽孢杆菌WB600。结果：成功筛选获得了一株产腺苷酸脱氨酶重组枯草芽孢杆菌WB600/pHY-AMPD,进一步在摇瓶中探究了发酵培养基成分对重组酶发酵的影响。获得了较优发酵培养基为：葡萄糖10 g/L、 酵母膏30 g/L、CaCl2 0.5 g/L、柠檬酸三钠1 g/L、NaH2PO4 10 g/L、K2HPO4 10 g/L、(NH4)2SO4 5 g/L,37 ℃、200 r/min发酵60 h摇瓶发酵液酶活力可达到（2 230±50） U/mL。结论：本研究实现了鼠灰链霉菌来源的腺苷酸脱氨酶基因在枯草芽孢杆菌中表达。     

转运系统集成改造提升大肠杆菌胞外蛋氨酸积累

通过构建大肠杆菌(Escherichia coli)W3110 MetD吸收系统编码基因metI、metN、metQ单个缺损菌株,获得胞外蛋氨酸吸收速率最小菌株;游离及染色体整合表达YjeH和YeaS分泌系统编码基因yjeH和yeaS,研究增强蛋氨酸分泌与弱化蛋氨酸吸收集成改造策略对菌体胞外蛋氨酸积累和生物量的影响,为理性构建蛋氨酸高产菌株提供可行策略。实验结果表明,基因metI的缺损对胞外蛋氨酸的吸收影响最大,吸收速率降低了16.7%;游离表达基因yjeH和yeaS,胞外蛋氨酸开始积累,胞外蛋氨酸最大积累量为0.21 g/L和0.18 g/L;染色体整合表达基因yjeH和yeaS,胞外蛋氨酸的最大积累量为0.48 g/L和0.25 g/L,与游离表达相比提高了128%和38.9%。增强蛋氨酸分泌与弱化蛋氨酸吸收集成改造策略对于促进胞外蛋氨酸的积累效果显著,可以作为理性构建蛋氨酸高产菌株的策略。     

代谢改造酿酒酵母生产番茄红素

番茄红素是一种具有较高商业价值的萜类化合物,具有良好的抗氧化性,对心血管疾病有预防作用,可通过微生物发酵法高效生产。为了提高酿酒酵母胞内番茄红素积累,过量表达了三酰甘油途径(TAG途径)的关键基因dga1(酰基辅酶A:二酰基甘油酰基转移酶)、pah1(磷脂酸磷酸酶),同时敲入ldp1(脂滴附着蛋白);继续在ypl062w位点敲入来源于肠沙门氏菌的acs1^L641P(胞内乙酰CoA合成酶),为番茄红素和脂质载体提供充足的前体;过表达pap1(聚腺苷酸聚合酶)以满足多个基因过表达的转录需求。综上,该文构建了一个适合番茄红素累积的细胞工厂,番茄红素单位产量为109.26 mg/g DCW。该研究通过代谢改造得到1株高产番茄红素重组菌,研究结果为后续进行发酵优化奠定了基础。     

Nanog蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及发酵优化

为高效制备可溶性人源Nanog蛋白,降低Nanog蛋白的使用成本。该研究通过分子克隆技术构建重组大肠杆菌(pET32a-Nanog),利用IPTG诱导进行可溶性融合表达。采用镍离子柱亲和层析法纯化产物并将纯化后产物进行肠激酶酶切后得到目的蛋白,Western blot鉴定该蛋白抗体结合的特异性并进一步优化发酵条件。结果表明,原核表达载体pET32a-Nanog构建成功,可在大肠杆菌中与硫氧还蛋白融合表达,融合蛋白经肠激酶酶切后得到相对分子质量约为38 kDa的蛋白,Western blot鉴定该蛋白可与Nanog抗体特异性结合。在摇瓶培养条件下,得到最优发酵条件是诱导温度37℃、IPTG浓度0.2 mmol/L、甘油为补料碳源;15 L发酵罐上进一步优化溶氧条件及温度控制方式,最终在溶氧设置在30%条件下,37℃(诱导期间30℃维持30 min)发酵12 h后得到最高Nanog产量1 386.4 mg/L,经蛋白纯化后纯度达到90%,为后续Nanog多克隆抗体的制备和基础医学实验研究奠定了基础。     

代谢工程改造酿酒酵母促进L-苯丙氨酸的合成

通过代谢工程改造酿酒酵母L-苯丙氨酸合成相关途径,强化L-苯丙氨酸合成并实现胞外积累,为后续深入挖掘酿酒酵母芳香族氨基酸合成和转运机制,利用酿酒酵母生产芳香族氨基酸及其高价值衍生物提供参考。首先对酿酒酵母中心代谢途径和莽草酸途径进行代谢改造,获得1株合成L-苯丙氨酸初步强化菌株,测得胞外L-苯丙氨酸和L-酪氨酸产量分别为2.49和6.54 mg/L。为了进一步增强L-苯丙氨酸的积累,敲除L-苯丙氨酸消耗途径基因ARO10和PDC5。最后,敲除TYR1阻断竞争性L-酪氨酸合成途径,胞外L-苯丙氨酸产量提高至45.40 mg/L,这是目前研究酿酒酵母L-苯丙氨酸从头合成的最高胞外产量。     

糖基转移酶GL24971对灵芝多糖合成的影响

灵芝作为一种典型的食药用真菌,其多糖是主要的活性物质之一,应用广泛。在多糖合成的途径中,糖基转移酶发挥着重要的作用。为探究葡萄糖基转移酶基因GL24971的过表达对灵芝多糖的影响,通过聚乙二醇转化法将过表达质粒转化至原生质体,用潮霉素抗性筛选,得到转化菌株。结果表明,转化菌株T1与T2的单位菌体胞外多糖最大产量分别为0.07、0.06 mg/mg,分别提高了132.4%、70.0%,而胞内多糖产量均为0.03 mg/mg,分别降低了10.7%、37.4%;其次,几丁质和β-1,3-葡聚糖含量降低;单糖组成中,半乳糖的比例减少,甘露糖的比例增加,但仍然以葡萄糖为主。研究结果为灵芝多糖产量的提高提供了新的思路,有利于促进多糖合成途径的进一步完善,也为后续研究灵芝中其余的糖基转移酶提供了参考。