青蛤多肽的酶法制备及对前列腺癌DU-145细胞的抑制活性

探讨青蛤多肽的制备工艺及体外抗前列腺癌DU-145细胞的活性。以氨基氮含量为检测指标,筛选最优酶种类并进行正交试验以获取最佳酶解青蛤内脏酶解工艺。经超滤截留、琼脂糖凝胶层析、高效液相色谱分离纯化及噻唑蓝（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT）活性筛选得到含有5 个氨基酸的多肽（Ile-Leu-Tyr-Met-Pro）。对所得多肽采用MTT法测定DU-145细胞增殖抑制率;采用倒置显微镜、Hoechst 33258染色及透射电子显微镜技术观察细胞形态学变化;采用荧光法检测细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平;采用线粒体膜电位检测DU-145细胞凋亡情况;采用免疫组织化学法检测非转移性克隆23型（nm23H1）蛋白的表达。结果表明：制备青蛤多肽最佳酶是木瓜蛋白酶,最佳酶解条件是料液比1:4、pH 7.0、加酶量1 500 U/g、温度45.0 ℃、酶解时间4 h;所得多肽对DU-145细胞的增殖具有明显的抑制作用,且呈时间与剂量依赖性;处理后的DU-145细胞出现凋亡的形态学特征;其质量浓度和细胞内ROS的表达量呈正相关关系;线粒体膜电位降低率从4.22%提高到25.07%;免疫组织化学法结果显示nm23H1蛋白的表达量增加。青蛤多肽能明显抑制DU-145细胞的增殖,并通过诱导其发生凋亡而发挥作用。     

长鳍金枪鱼多肽制备及其对H2O2诱导的张氏肝细胞的保护作用

目的:以长鳍金枪鱼废弃物为原料提取多肽,探究其对H2O2诱导的张氏肝细胞的保护作用。方法:以H2O2诱导张氏肝细胞损伤建立细胞模型组,以相对增殖率为指标筛选长鳍金枪鱼废弃物最适酶种,通过正交试验确定最佳酶解条件。酶解产物经超滤、阴离子交换色谱、凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱方法纯化分离得到多肽,用噻唑蓝(MTT)比色法对其每步分离效果进行评价。多肽活性的评价是利用试剂盒方法测定张氏肝细胞上清液中AST、ALT、MDA、ADH和SOD的含量,倒置显微镜观察细胞形态及流式细胞仪检测多肽对H2O2诱导后的张氏肝细胞凋亡的影响。结果:最适酶种为胰蛋白酶,最佳酶解条件为料液比1∶3(g/mL),pH 9,加酶量900 U/g,温度45℃,时间5 h。经一系列纯化后制成多肽,命名为长鳍金枪鱼多肽。其氨基酸序列为Gly-Ala-Pro-Gly-Glu-Arg-Gly-Ser-Lys-Cys-Phe-Lys。经长鳍金枪鱼多肽作用于H2O2诱导的张氏肝细胞后,ALT、AST、ADH和MDA含量下降,SOD含量上升。通过流式细胞仪检测发现晚期凋亡细胞相比于模型组减少明显。结论:利用酶解方法提取的长鳍金枪鱼多肽对H2O2损伤的张氏肝细胞具有一定的保护作用。     

不同冻藏温度对小黄鱼贮藏期间品质变化的影响

为探究超低温条件下的小黄鱼品质变化,该实验通过冻结曲线、总挥发性盐基氮（TVB-N）含量、持水力、Ca2+-ATPase(Ca2+-腺苷三磷酸酶)活性含量、羰基含量、总巯基含量以及冰晶形态等指标,综合表征-18、-25和-45℃等3种冻藏温度对小黄鱼品质变化的影响。结果表明-18、-25和-45℃组通过最大冰晶生成区域时间分别为230、95和60 min,超低温（-45℃）组用时最短;且-45℃冻藏下小黄鱼组织中的冰晶面积和直径比其他两组小、分布更均匀,150 d时,肌肉组织间隙均增大,而-18和-25℃两组间隙远大于-45℃组;冻藏200 d,-45℃组的小黄鱼TVB-N含量与羰基含量最小,分别为7.96 mg/100 g与30.60 nmol/mg prot;持水力、总巯基含量与Ca2+-ATPase活性含量最高,分别为74.62%、0.36 mmol/g prot与4.78μmol/mg,显著优于-18和-25℃组（P<0.05）。随着贮藏时间的延长,各温度下的小黄鱼品质均变化,但超低温（-45℃）下的小黄鱼品质变化最缓。因此,超低温冻藏对长期贮藏小黄鱼的品质劣变有延缓作用...     

文蛤寡肽对高脂饮食诱导小鼠肾损伤的修护作用

目的：研究文蛤寡肽（Meretrix meretrix oligopeptides,MMO）对高脂饮食诱导小鼠肾损伤的修护作 用。方法：建立高脂饲料致小鼠慢性肾损伤模型,通过MMO灌胃30 d后,测定小鼠肾脏指数,检测小鼠血清甘 油三酯（triglyceride,TG）、总胆固醇（total cholesterol,TC）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol,HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol,LDL-C）浓度,以及小鼠肾组织 匀浆中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px） 活力和丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量,计算小鼠动脉粥样硬化指数（atherosclerosis index,AI）,苏木 素-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色观察小鼠肾脏病理学改变,免疫组化法测定肾组织α-平滑肌肌动蛋白 （α-smooth muscle actin,α-SMA）、转录生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）蛋白表达量。 结果：MMO组与模型组比较,小鼠肾脏指数,血清中TG、TC、LDL-C浓度及AI显著下降,HDL-C浓度显著升 高,肾组织匀浆中SOD、GSH-Px活力显著升高,MDA含量显著降低,HE染色观察肾组织结构明显好转,免疫 组化结果显示MMO可降低肾损伤小鼠α-SMA、TGF-β1蛋白表达水平。结论：MMO对高脂饮食诱导的小鼠肾损 伤有较为明显的修护作用。     

小黄鱼低温贮藏过程中内源性蛋白酶活性及其水分变化

以小黄鱼(Larimichthys polyactis)为研究对象,测定组织蛋白酶、α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase, AG)和β-乙酰基氨基葡萄糖苷酶(β-acetylglucosaminidase, NAG)的酶活力,利用低场核磁共振(low-field nuclear magnetic resonance, LF-NMR)技术测定水分迁移,以质构、持水力为指标,探讨小黄鱼肉在-18、-25、-45℃冻藏(0～200 d)过程中酶活力和水分迁移以及品质变化规律。结果表明,随着冻藏时间的延长,3种温度下鱼肉的硬度、弹性和咀嚼性均出现大幅度下降趋势;组织蛋白酶B、H和L呈先下降后上升的变化趋势,-45℃组酶活性始终显著低于其他2组;AG和NAG活性显著上升;鱼肉总体水分含量(A)、结合水含量(A₂₁)、不易流动水含量(A₂₂)均减少,而自由水含量(A₂₃)增加;-45℃组鱼肉持水力下降速率最缓慢。该研究结果显示,小黄鱼在长期冻藏过程中超低温(-45℃)下能更好地保持鱼肉品质。     

青蛤酶解多肽对RAW264.7巨噬细胞的免疫调节作用

研究酶解法制备的青蛤多肽（Cyclina sinensis peptides,CSP）对RAW264.7巨噬细胞的免疫调节作用。以RAW264.7巨噬细胞相对增殖率为指标,选用胃蛋白酶对青蛤肉进行酶解,酶解液经超滤、冷冻干燥后,采用噻唑蓝（methyl thiazolyltetrazolium,MTT）法筛选出增殖活性最高的组分进行免疫调节作用研究。采用MTT细胞增殖实验、倒置显微镜观察、中性红吞噬实验、硝酸根还原酶法及酶联免疫吸附检测法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）测定CSP-5对RAW264.7巨噬细胞的生长与增殖、细胞形态、吞噬能力、一氧化氮（nitric oxide,NO）分泌能力及细胞因子白介素（interleukin,IL）-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）分泌能力的影响;同时还研究了CSP-5对巨噬细胞各周期分布的影响。结果表明,分子质量小于3 kDa的CSP-5对RAW264.7细胞的生长与增殖具有明显的促进作用,且主要作用于G0/G1期,对细胞吞噬能力、NO分泌能力和细胞因子分泌能力的提高具有显著的促进效果;形态学观察结果显示经CSP-5作用后巨噬细胞体积变大且长出较多伪足。由此可知,CSP-5具有激活巨噬细胞增强机体免疫力的潜在作用。     

双齿围沙蚕抗凝血肽的制备及其抗血栓作用

目的:探讨双齿围沙蚕抗凝血肽(anticoagulant peptides from Perinereis aibuhitensis,PAAP)的制备及其抗血栓作用。方法:以抗凝活力为检测指标,筛选最佳酶对沙蚕进行酶解。酶解产物经超滤、阴离子交换层析、凝胶过滤层析和反相高效液相色谱法分离纯化,得到具有最强抗凝活力的沙蚕寡肽,将此肽命名为PAAP并测定其急性毒性作用。采用角叉菜胶所致的小鼠尾部血栓形成实验、三氯化铁所致的大鼠动脉血栓形成实验及二磷酸腺苷(adenonisine disphosphate,ADP)诱导的血小板聚集实验,研究PAAP的抗血栓作用。结果:选取碱性蛋白酶作为最佳酶对沙蚕进行酶解,经过分离纯化后得到一条氨基酸序列:脯氨酸-缬氨酸-谷氨酸-精氨酸-赖氨酸(Pro-Val-Glu-Arg-Lys)。经测定,该寡肽的体外抗凝活力可达(1 320.0±20.3)U/g。PAAP的最大耐受量为11.0 g/(kg·d)且未出现小鼠异常及死亡现象,体内实验表明PAAP对小鼠尾部血栓的形成、大鼠动脉血栓的形成及ADP诱导的血小板聚集均有明显抑制作用。结论:从双齿围沙蚕中提取出的抗凝肽PAAP具有抗血栓作用。     

双齿围沙蚕多肽的制备及其抗肺癌A549细胞活性

探讨双齿围沙蚕酶解多肽制备的关键技术及其对肺癌A549细胞的作用。以增殖抑制率为指标,确定最佳酶种并根据单因素试验和正交试验确定其最佳酶解工艺。经超滤获得1~3 ku的酶解液,通过阴离子色谱、凝胶过滤色谱和制备色谱对其进行进一步的分离纯化。采用四甲基偶氮唑蓝法测定沙蚕多肽PAP对肺癌A549细胞的增殖抑制率并通过倒置显微镜、吖啶橙/溴化乙锭荧光染色及Hoechst荧光染色观察其细胞形态的变化。实验结果表明最佳酶种是碱性蛋白酶,其最佳酶解条件为:酶解温度50℃、pH 11、料液比1∶1(g/mL)、酶解时间6 h、加酶量300 U/g。经纯化获得的多肽命名为PAP,其氨基酸序列为Ile-Glu-Pro-Gly-Thr-Val-Gly-Met-Met-Phe,且PAP对A549细胞的作用呈时间与剂量依赖关系,作用后细胞出现了凋亡的形态学特征。因此,PAP能明显抑制肺癌细胞A549增殖,可以诱导其发生凋亡而发挥抗肿瘤作用。     

𩽾𩾌鱼皮酶溶胶原蛋白肽对小鼠非酒精性脂肪肝的影响及作用机制

为探究鮟鱇鱼皮酶溶胶原蛋白肽(pepsin-solubilized collagen peptides from Lophius litulo skin,PSCP)对高脂饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪肝的影响及其机制,48只C57BL/6小鼠喂食高脂饲料4周诱导非酒精性脂肪肝模型,采用二甲双胍,低、中、高剂量PSCP处理模型小鼠6周,分别测定小鼠血清生理生化指标、肝脏氧化应激水平、肝脏组织病理学变化和蛋白的表达水平。实验结果表明:与模型组相比,二甲双胍和高剂量PSCP显著降低了小鼠血清中总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein,LDL-C)水平及谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)和谷丙转氨酶(alanime aminotransferase,ALT)活力,显著提高了高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平;二甲双胍及中、高剂量PSCP显著升高了小鼠肝脏中谷胱甘肽(glutathione,GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)含量,显著降低肝脏丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平。苏木精-伊红染色和透射电镜结果显示,二甲双胍组和PSCP组小鼠肝脏结构明显好转。蛋白免疫印迹结果显示,与正常组相比,模型组小鼠肝脏中AMPKα、p-AMPKα和IκBα的蛋白表达量显著降低,SREBP-1和p65、p50、IKKα的蛋白表达量显著升高;而给予二甲双胍和PSCP后AMPKα、p-AMPKα和IκBα的蛋白表达量增加,SREBP-1和p65、p50、IKKα的蛋白表达量降低。研究结果表明,PSCP可显著改善非酒精性脂肪肝小鼠的生化指标,恢复肝组织结构,其改善机制可能与AMPK/NF-κB信号通路转导相关。     

沙蚕活性蛋白酶诱导人肺癌SPC-A-1细胞凋亡的机制研究

本文探讨了沙蚕活性蛋白酶(Nereis active protease,NAP)诱导SPC-A-1细胞凋亡机制。采用MTT法检测NAP对SPC-A-1细胞的抑制作用,倒置显微镜及AO/EB染色观察SPC-A-1细胞的形态学的变化,采用流式细胞术检测细胞早期凋亡率和细胞膜电位的变化;并通过Western Blotting检测细胞中凋亡相关蛋白的表达变化。NAP对SPC-A-1细胞活性具有明显的抑制作用且呈现剂量和时间的依赖性;NAP作用后细胞出现凋亡的形态学特征;经流式细胞术检测结果显示,随着NAP作用浓度的增加,SPC-A-1细胞的早期凋亡率从13.50%提高到22.98%,且线粒体膜电位下降所占的百分率从12.95%提高到25.28%。Western Blotting结果显示,50μg/mL NAP作用24h后,Bax/Bcl-2的比率相对对照组明显增加了6.05倍;Cyt-C、Cleaved-Caspase 9、Cleaved-Caspase 3、Cleaved-PARP等含量显著上调,相对表达量分别达到对照组的2.32、3.07、3.68、1.36倍。NAP诱导SPC-A-1细胞凋亡的作用机理有可能是通过下调Bcl-2蛋白的表达、上调Bax蛋白的表达,进而诱导线粒体膜电位的下降,促使Cyt-C的转移以及激发Caspase家族发生级联反应最终导致SPC-A-1细胞的凋亡。