食品检测用产肠毒素大肠埃希氏菌标准物质的制备及评价

目的 制备并评价产肠毒素大肠埃希氏菌（ETEC）标准物质。方法 分别用基质辅助激光解吸电离（MALDI-TOF MS）、生化、16 s RNA基因序列测定三种方法确认菌株种属。采用冷冻干燥技术制备600个ETEC标准样品（103CFU/样品）;从中随机抽取20个进行均匀性检验;模拟25℃和37℃的运输温度测试样品的运输稳定性,同时在4℃和-20℃的条件下进行保藏稳定性检验。组织3家实验室对样品进行协同验证。最后选择20件食品基质来验证样品的使用效果。结果 生化、MALDI-TOF MS、16 s RNA基因序列鉴定CMCC(B)43208为大肠埃希氏菌,lt、stp、sth基因确认其为ETEC。均匀性检验中,单因素方差分析得F=1.48,小于FINV(0.05,19,20)。稳定性检验中,在25℃和37℃保藏7 d后结果为103CFU/样品,在-20℃保藏60 d和4℃保存28 d后结果为103CFU/样品。协同标定实验中,3家实验室检测样品中菌株均为ETEC(103CFU/标准样品)。使用效果评价中,ETEC标准样品加入20种食品基质后均可检出,而本底对照均未检出。结论 本实验制备的...     

可生食蔬菜中单核细胞增生李斯特菌生存特征研究

目的 探究可生食蔬菜品种、温度、接种部位对单核细胞增生李斯特菌（以下简称单增李斯特菌）存活的影响,为可生食蔬菜中单增李斯特菌的风险评估和关键控制措施提供理论依据。方法 以冻干定量单增李斯特菌为菌株来源,以彩椒、洋葱、黄瓜、圣女果和生菜5种可生食蔬菜的表面和切面为单增李斯特菌的接种点,在4 ℃、25 °C条件下培养7 d,定期监测每份样本中的单增李斯特菌的菌量,对其生长情况进行分析。结果 单增李斯特菌冻干菌种不同瓶间菌量均匀（F=1.923,P<0.05）,-20 ℃储存28 d后的复苏率为93.3%±4.2%。在4 ℃条件下,除了彩椒表面、黄瓜切面、生菜表面和生菜切面外,单增李斯特菌在其他蔬菜上放置7 d后均未见显著生长（δ<0.5 log₁₀ CFU/mL）。在25 ℃条件下,单增李斯特菌在彩椒、洋葱、圣女果、生菜以及黄瓜切面上均呈现为支持生长［δ为（1.16±0.35）~（2.68±0.18）log₁₀ CFU/mL］。单增李斯特菌在黄瓜切面、生菜表面和切面放置7 d后,菌量仍持续增长,在生菜的表面和切面生长趋势和浓度基本一致。结论 单增李斯特菌在可生食蔬菜上的存活能力与蔬菜种类、表面与切面、储存温度等条件密切相关,温度的控制对降低其在可生食蔬菜中的风险至关重要。生菜和切后的黄瓜作为单增李斯特菌高风险食品,应引起风险评估的重视。     

市售普洱茶中真菌群落构成和物种多样性分析方法研究

目的 综合应用传统分离培养、内部转录间隔区(ITS)测序和高通量基因组学测序技术,建立分析市售普洱茶中真菌群落构成和物种多样性的新方法。方法 按照GB 4789.15—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》对普洱茶样本进行可培养真菌检测和分离纯化,对分离到的菌株进行ITS测序并在NCBI数据库中进行Blast分析;采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取普洱茶样本中真菌基因组DNA,进行聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增子测序,并对高通量测序数据进行OTUs聚类,开展物种构成及多样性分析。结果 通过传统分离培养方法获得12株真菌,主要为曲霉和毛霉,其中黑曲霉占比最高(25.00%,3/12)。基因组学的物种分布结果显示,普洱茶样本中的真菌物种多样性和均匀度较低,存在数量占比较高的优势物种;占比最高的为子囊菌门(74.03%),属的水平上以芽生葡萄孢酵母属为主(49.43%),曲霉属占比较低(14.04%)。结论 本研究综合应用传统分离培养、ITS测序和高通量基因组学测序技术,构建了普洱茶中真菌群落构成和物种多样性分析的新方法,为普洱茶中微生物群落构成及其对品质和安全性影响的进一步研究提供了思路和参考。     

乳粉中克罗诺杆菌属阪崎肠杆菌能力验证样品制备及应用

目的 制备均匀性及稳定性均满足要求的克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验能力验证样品,用于组织能力验证考核。方法 通过生化及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱方法鉴定背景菌株及所使用的克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)菌株。采用冷冻干燥技术制备均匀性及稳定性均满足要求且各种菌含量为10⁴ CFU/瓶的能力验证菌球。依据CNAS-GL003∶2018《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》,随机抽取阳性样品和阴性样品各20份进行均匀性检验,再将样品存放于-20 ℃、4 ℃进行保藏稳定性检验,存放于25 ℃、37 ℃进行运输稳定性检验。依据GB 4789.40—2016制定作业指导书并发放样品,回收各实验室结果进行统计。结果 目的菌株及背景菌株的鉴定结果均正确,均匀性、运输稳定性及保藏稳定性检验均符合能力验证样品的要求。依据评价原则及25家实验室反馈的结果,2021年度考核结果满意率为100%。结论 乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)能力验证样品满足本年度能力验证的要求,为参加考核的检测机构提供了外部质控考核结果。     

肠道集聚性大肠埃希氏菌菌体和gDNA标准物质的研制

目的：为满足肠道集聚性大肠埃希氏菌准确检测的实验室质量控制和能力验证需求，研制具有我国自主知识产权且具有全基因组测序信息的均匀稳定的肠道集聚性大肠埃希氏菌菌体及gDNA标准物质。方法：利用二代高通量测序技术对肠道集聚性大肠埃希氏菌（CMCC 44841）进行全基因组测序，明确CMCC 44841的种属、血清分型、多位点序列分型和毒力基因。对CMCC 44841进行astA、aggR、pic特征性基因聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）确认。采用冷冻干燥技术制备含量为103 CFU/样品的菌球和含量为20 ng/样品的gDNA小球。参照CNAS-GL017对20 个菌球样品进行均匀性检验，采用单因素方差分析对结果进行统计分析。将样品分别于－20、4、25 ℃和37 ℃条件下保藏，对其贮藏稳定性和运输稳定性进行评价。组织3 家实验室进行协同标定和验证。使用5 种不同基质的即食食品样本，按照国标法检验标准物质的适用性。结果：利用生物信息学分析，CMCC44841基因组大小为5.057 285 Mb，GC含量为50.6%，编码区基因5 173 个。种属鉴定结果为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），血清预测结果为O127:H21，MLST为ST40型，携带除aggR、astA、pic之外其他相关的毒力基因。PCR扩增出astA、aggR、pic片段大小分别为102、400 bp和1 111 bp。菌体标准物质均匀性检验结果F=1.59，符合标准物质的要求。菌体和gDNA标准物质样品于－20 ℃和4 ℃保藏60 d，25 ℃保藏7 d，37 ℃保藏5 d后仍然稳定。经3 家实验室协同标定，菌体标准物质样品含量均为103 CFU/样品。20 件不同基质的食品样品加入肠道集聚性大肠埃希氏菌标准物质进行检验，均可以检出。结论：本研究所制备的肠道集聚性大肠埃希氏菌菌体及gDNA标准物质所用菌株来源于我国国内分离菌株，且具有明确的全基因组序列信息，均匀性和稳定性均符合要求，适用性良好，能够满足食品检测实验室的质量控制和能力验证的需求。     

食品检测用副溶血性弧菌标准物质的制备和评价

该研究制备并检测了不含基质的副溶血性弧菌标准物质。用质谱、生化、16S RNA基因序列测定3种方法对菌株CMCC20030分别确认种属。先采用冷冻干燥技术制备800个样品[103 CFU/样品(20 μL)]。然后随机抽取20个样品进行均匀性检验;再将样品存放25、37 ℃分别在1、3、5、7 d取出进行运输稳定性检验,将样品存放4 ℃分别于7、14、28 d进行短期保藏性检验,将样品存放-20 ℃分别于14、28、60 d的保藏稳定性检验。组织5家实验室对样品进行协同标定。最后用食品基质检测使用效果。菌株CMCC20030经3种方法均鉴定为副溶血性弧菌。均匀性检验中,F样品=1.930,小于FINV（0.05,19,20）。稳定性检验中,于-20 ℃保藏60 d、4 ℃保存28 d、25 ℃保藏7 d和37 ℃保藏3 d后,活菌含量103 CFU/样品。协同标定实验中,5家实验室结果均为103 CFU/样品。使用效果实验中,20种食品基质加入样品后均可以检出,本底对照均未检出。制备的不含基质的副溶血性弧菌样品满足标准物质要求,可依据不同目的灵活使用。     

基于叶绿体rpoC1序列在山药分子鉴定中的应用

目的 研究基于rpoC1序列分析,建立山药物种鉴定的新方法。方法 利用DNA条形码技术对收集到的7个山药样本提取基因组DNA,以rpoC1基因引物进行PCR扩增、测序,将所得序列在NCBI数据库进行Blast比对,同时从GenBank数据库下载薯蓣属、木薯属和番薯属rpoC1序列,应用MEGA7.0软件计算种内和种间的(K2P)遗传距离,并构建邻接(NJ)系统聚类树。结果 7个山药样本rpoC1基因获得成功扩增和测序。7个山药rpoC1序列及GenBank下载9个薯蓣rpoC1序列和2个木薯番薯rpoC1序列分析显示,山药样本最大种内K2P遗传距离0.009远远小于山药与木薯番薯的种间K2P遗传距离0.104~0.118,同时也小于山药与盾叶薯蓣和穿龙薯蓣的种间K2P遗传距离0.026~0.035,构建的系统发育树显示山药与盾叶薯蓣和穿龙薯蓣、木薯和番薯单独聚为一类。结论 rpoC1序列可为食用山药物种鉴定提供新的分子鉴定方法。     

2018—2020年度乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)能力验证样品的研制及其应用

目的 制备乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验能力验证样品,并应用于2018—2020年度实验室能力验证考核。方法 将背景菌株和克罗诺杆菌属通过生化、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定确认菌株种属。采用冷冻干燥技术制备的阴性样品(含背景菌)和阳性样品(含背景菌和克罗诺杆菌属)。随机抽取阳性样品和阴性样品各20份进行均匀性检验,然后将样品分别存放于-20℃和4℃进行储藏稳定性检验,存放于25℃和37℃进行运输稳定性检验。向参加考核的实验室发放样品并提供作业指导书,回收各实验室结果进行统计。结果 菌株种属鉴定结果与预期结果一致,均匀性、储藏稳定性和运输稳定性均满足要求。2018—2020年度考核结果满意率分别为97.1%、94.7%和100%。结论 制备的样品满足此能力验证项目的需求,通过组织能力验证考核可以反映出我国实验室之间差异,有助于进一步提高实验室检验水平。     

2019—2020年度食品中副溶血弧菌能力验证样品的研制及其应用

目的 制备食品中副溶血弧菌检验能力验证样品,并应用于2019—2020年度实验室能力验证考核。方法 将5种背景菌株和副溶血弧菌通过生化、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定确认菌株种属。采用冷冻干燥技术制备阳性样品和阴性样品,阴性样品仅含有背景菌株,阳性样品在背景菌的基础上添加有副溶血弧菌。随机抽取20份样品进行均匀性检验,将样品存放于-20℃、4℃进行保藏稳定性检验,将样品存放于25℃、37℃进行运输稳定性检验。向参加考核的实验室发放样品并提供作业指导书,回收各实验室结果进行统计。结果 菌株种属确认与预期结果一致,阴性样品和阳性样品的均匀性和稳定性均满足要求。2019年和2020年考核结果满意率分别为87.5%和90%。结论 本研究制备的样品满足食品中副溶血弧菌能力验证项目的要求,通过组织能力验证考核可以反映出我国实验室之间的差异,有助于进一步提高实验室检验水平。     

荧光PCR法检测原料乳中大肠埃希氏菌喹诺酮类的耐药基因

目的 建立喹诺酮类抗生素主要耐药基因的TaqMan荧光PCR检测方法,为原料乳中耐药大肠埃希氏菌的监测提供技术方案。方法 利用Chelex 100法快速获取细菌基因组DNA,通过对aac(6’)-Ib-cr和qepA基因的序列分析,利用Primer Express 3.0软件设计特异性引物和探针,建立单重和双重TaqMan荧光PCR方法。通过耐药基因阳性菌株和原料乳中分离大肠埃希氏菌菌株,对方法进行评估。结果 以Chelex 100法快速提取耐药基因阳性菌株细菌基因组DNA为模板,建立的aac(6’)-Ib-cr和qepA基因的单重和双重荧光PCR反应均有特异性曲线扩增,方法灵敏度为菌液浓度10_^-4 CFU/mL。北京地区52份原料乳中共分离出32株大肠埃希氏菌,利用建立的双重荧光PCR方法检测aac(6’)-Ib-cr和qepA基因结果为阴性,和环丙沙星肉汤稀释法药敏结果一致。结论 本方法的建立为原料乳中大肠埃希氏菌常见喹诺酮类耐药基因的快速检测提供了新的技术手段。