烟草烟碱相关miRNA筛选及验证

为挖掘烟草中可能参与烟碱调控相关的miRNA,利用生物信息学方法,进行了烟草全基因组水平的miRNA鉴定,筛选出烟碱相关的miRNA,并利用qPCR和GC-MS技术对相关过表达miRNA材料开展了功能验证.结果显示,利用红花大金元3个时期5个不同组织(根、茎、叶、花和腋芽)共39个样品的miRNA测序数据,共鉴定出了2...     

玉溪、许昌烤烟烟叶中淀粉酶基因的表达及酶活性分析

为分析河南、云南两地烤后烟叶中糖含量差异形成的原因,以许昌、玉溪成熟期烤烟中部烟叶为材料,通过基因芯片数据寻找与淀粉降解相关的差异基因。利用实时定量PCR和淀粉酶活性分析进行验证,并测定淀粉、总糖的含量(质量分数)。结果表明:获得4个与淀粉降解相关的差异基因,其中2个为α-淀粉酶基因、2个为β-淀粉酶基因,这4个基因在玉溪烟叶中的表达量明显高于许昌烟叶。玉溪烟叶中的α-和β-淀粉酶活性高于许昌烟叶。在玉溪、许昌成熟期中部烟叶中,淀粉含量分别为33.00%和35.00%,两者差异不大。烤前烟叶的总糖含量玉溪烟叶(2.10%)低于许昌烟叶(3.20%),而烤后烟叶的总糖含量玉溪烟叶(36.46%)高于许昌烟叶(20.60%)。表明影响烤后烟叶总糖含量的主要因素为淀粉酶,而不是烤前烟叶的淀粉积累量。     

烟草查尔酮异构酶基因2(NtCHI2)功能分析

烟草查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)是黄酮类代谢的一个关键酶,烟草中有两个基因拷贝(NtCHI1、NtCHI2),相关研究多集中在NtCHI1基因,对NtCHI2的研究较少。为研究烟草NtCHI2的功能,主要以NtCHI2的过表达和干扰植株叶片为材料,进行了实时定量PCR和CHI活性分析以及芸香苷含量检测,同时进行了NtCHI2体外表达蛋白的酶活分析。结果表明:NtCHI2体外表达蛋白具有查尔酮异构酶活性;过表达株系中NtCHI2的表达量升高5～75倍,但CHI酶活性和芸香苷含量基本没有变化;干扰株系中NtCHI2的表达量降至70%,CHI酶活性和芸香苷含量分别降低50%和90%。烟草NtCHI2参与芸香苷的合成代谢调控,在一定程度上NtCHI2基因的表达量和芸香苷的含量正相关。     

CRISPR/Cas9介导烟草多基因编辑体系的应用

CRISPR/Cas9是一种新型的基因组定向编辑技术,近年来在烟草基因组的定向编辑中得到了广泛应用。CRISPR/Cas9介导的多基因编辑技术在许多物种中表现出很大的潜力,为了探索CRISPR/Cas9介导烟草多基因编辑的技术体系,本文针对烟草PCS1、HMA2、eIF4E、TOM3、TOM1 5个不同性状相关的基因构建了多靶点敲除的CRISPR/Cas9系统,并借助农杆菌介导的遗传转化技术转化烟草品种K326。对阳性植株的筛选、靶位点基因组的PCR扩增与测序分析表明,构建的CRISPR/Cas9多基因编辑系统成功转化到烟草中,能够同时靶向突变5个基因。5个基因同时突变的检出率为53.8%,单基因的突变检出率在76.9%与92.3%之间。进一步的脱靶检测分析显示,在所预测脱靶的候选位点上均未发生脱靶现象。本文构建的CRISPR/Cas9多基因编辑系统可将多个基因进行有效突变,为烟草基因功能研究和基于CRISPR/Cas9技术的多性状改良奠定了基础。      

植物研究中的流式细胞术及其在烟草中的应用进展

流式细胞术作为一种快速、灵敏的细胞分析分选技术,目前已广泛应用于植物学研究的多个领域。为了拓展流式细胞术在烟草研究中的应用范围,介绍了流式细胞仪的工作原理,并阐述了流式细胞术在植物细胞核DNA含量和倍性分析、植物核型分析及分选、细胞分选与其他技术的联合等学科领域的应用概况。在总结流式细胞术在烟草相关研究领域应用现状的基础上,展望了流式细胞术在烟草单细胞组学、病害防治和烟气毒理学检测等方面进一步研究与应用的可能性。     

烟草低温早花相关基因NtDUF599的表达及功能分析

为研究烟草低温诱导早花的作用机制,利用转录组分析筛选获得了烟草低温早花相关基因NtDUF599。NtDUF599基因编码一个包含236个氨基酸的未知功能蛋白,受低温诱导高表达。构建该基因的RNAi干扰(RNA interference,RNAi)载体,并通过农杆菌介导法进行烟草遗传转化,获得10个转基因株系。将转基因株系和非转基因对照株系在苗期低温(12℃)处理10 d后,在正常条件下生长至现蕾期。结果显示,转基因烟株的现蕾时间比对照提前10 d左右,且叶片数目减少。本研究首次发现DUFs(Domain of unknown functions)基因参与烟草低温诱导早花过程。     

高效液相色谱-三重四极杆质谱法同时测定烟叶中10种多酚类化合物

为研究烟叶中的植物多酚类化合物,利用高效液相色谱-三重四极杆质谱(HPLC-TQMS)技术,建立了同时分析烟叶中山奈酚(Kaempferol)、花青素(Cyanidin)、氯化飞燕草色素(Delphinidin chloride)、鼠李金(Rhamnazin)、绿原酸(Chlorogenic acid)、氯化飞燕草素3-O-β-吡喃葡糖苷(Delphinidin 3-O-β-glucopyranoside chloride)、原花青素B2(Procyanidine B2)、氯化花青素鼠李葡糖苷(Keracyanin chloride)、芸香苷(Rutin)和莨菪亭(Scopoletin)等10种植物多酚类化合物质量分数的方法。采用实时离子多反应检测模式,获得10种植物多酚类化合物的特征碎片离子峰,并对烟草花叶病毒(TMV)感染的烟叶样品进行了测定。结果表明:①10种植物多酚类化合物在线性范围内的相关系数(r)为0.999 0～0.999 6,方法的检出限为1～200μg/L,日内精密度(RSD)为0.64%～8.72%,日间精密度(RSD)为1.05%～7.93%;回收率为79.66%～112.74%;②TMV感染极显著(p0.01)增加了烟叶中山奈酚、花青素、氯化飞燕草色素、氯化飞燕草素3-O-β-吡喃葡糖苷和芸香苷的质量分数,显著(p0.05)降低了烟叶中鼠李金的质量分数,增加了绿原酸的质量分数;③TMV病毒感染对原花青素B2、氯化花青素鼠李葡糖苷和莨菪亭的影响不大,差异不显著。该方法具有良好的灵敏度、精密度和回收率,可用于同时分析植物多酚类化合物。     

烟草慢阴离子通道蛋白基因NtSLAH1的克隆及表达分析

为了揭示烟草慢阴离子通道蛋白(Slowly activating Anion Channel,SLAC)家族成员在氯离子转运过程中的作用,通过同源克隆的方法从栽培烟草K326中克隆到1个SLAC同源基因(SLAC Homologue),命名为NtSLAH1,其开放阅读框长度为1107 bp,编码368个氨基酸,表达蛋白定位在细胞质膜上。与已报道的其他植物SLAH相比,NtSLAH1与拟南芥SLAH1和SLAH4序列相似性更高、进化距离更近。实时定量荧光PCR(qRT-PCR)结果显示,NtSLAH1在根中的表达量最高,高浓度NaCl处理下其表达量下降,表明NtSLAH1可能在烟草盐胁迫响应及氯离子吸收过程中发挥重要作用。     

普通烟草NtNDPK4基因的克隆与表达分析

为揭示核苷二磷酸激酶在烟草中的功能和作用机制,从烟草K326克隆获得了1个核苷二磷酸激酶基因并命名为NtNDPK4,CDS长度为678 bp,编码225个氨基酸。生物信息学分析表明,NtNDPK4蛋白分子量大小24.95 kDa,pI约8.34,亚细胞定位预测在叶绿体上,进化分析显示该蛋白属于NDPKⅡ型,顺式作用元件分析预测该基因启动子含有激素和光照响应的作用元件。组织表达特异性分析结果显示,NtNDPK4在烟草各组织中均有表达。在MeJA、ABA、GR-24、IAA、GA和6-BA等激素处理下,NtNDPK4基因的表达显著上调,尤其是GA处理后NtNDPK4基因表达上调了近50倍。黑暗生长的烟草幼苗恢复光照24 h后,NtNDPK4基因表达明显上调。这表明烟草NtNDPK4基因可能参与激素和光照响应。     

UPLC-MS/MS法测定新鲜烟草中的脱落酸和茉莉酸

为更加快速准确地测定烟草中的酸性植物激素,通过优化样品的前处理条件,建立了超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定烟草中脱落酸和茉莉酸的方法。结果表明:1脱落酸和茉莉酸的检出限分别为0.082和0.027 ng/m L,加标回收率均在96.4%~110.8%之间,脱落酸的日内和日间相对标准偏差(RSDs)均低于3.86%,茉莉酸的日内和日间RSDs均低于4.53%。2该方法样品用量仅为25 mg;所采用的负离子检测模式选择性高、干扰小。适用于烟草样品中酸性植物激素内源性水平的准确检测。