黑曲霉葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的表达及其高效发酵研究

葡萄糖氧化酶是一类能催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸-8-内酯的酶类,在食品、药品以及生物传感器等领域具有广泛的应用前景.从黑曲霉中克隆出葡萄糖氧化酶编码序列,在毕赤酵母中实现了组成型和诱导型表达并分析了其酶学性质和发酵条件.结果 表明:黑曲霉葡萄糖氧化酶的编码基因长度为1 818 bp,编码605个氨基酸,具有21个氨...     

小麦病程相关蛋白wheatwin 1的表达及其对黄曲霉生长及产毒的影响

黄曲霉在储粮中的大量生长可严重危害粮食的储藏品质甚至产生真菌毒素。研究表明,小麦籽粒中含有多种病程相关蛋白,具有较强储藏霉变抗性的小麦品种胚部含有较多的病程相关蛋白,但其对储粮霉菌的生长和产毒的影响尚不清楚。通过PCR手段扩增从小麦基因组DNA中扩增出了病程相关蛋白wheatwin 1基因并将其在大肠杆菌中进行了表达,对wheatwin 1蛋白进行复性和纯化后分析其对黄曲霉生长及产生毒素的影响。结果表明编码成熟wheatwin 1蛋白的DNA序列长度为378 bp,将其在大肠杆菌中与谷胱甘肽转移酶融合表达可获得包涵体蛋白。将包涵体蛋白复性并利用Thrombin酶切后获得了具有核酸酶活性的wheatwin 1,其可降解黄曲霉RNA;进一步研究表明100 g/m L wheatwin蛋白可显著抑制黄曲霉孢子的萌发和黄曲霉毒素的积累。为进一步揭示wheatwin蛋白对黄曲霉生长和产毒的机理研究奠定了基础。     

粮仓储粮霉变CO2法监测值主要影响因素

利用检测粮堆二氧化碳(CO_2)浓度变化的方法对储粮霉变进行监测,但该方法为间接测定,需对影响粮堆CO_2检测值的粮堆相关因素及传感器相关参数进行全面分析。试验结果表明,不同温度下储粮中霉菌生长早期阶段的霉菌增长量均与CO_2浓度变化同步,两者相关性系数0.99;较低的温度可使霉菌生长产气量显著降低,在霉菌生长量相当的状态下,30℃比20℃条件下测得的粮堆CO_2浓度值高4.7倍。粮食颗粒间空隙度等多种因素均可显著影响CO_2气体扩散,稻谷粮堆比小麦粮堆的孔隙度高约30%,稻谷粮堆在相距CO_2发生源50cm的监测点比小麦粮堆测得的峰值浓度高50%,峰值时间提前4d。对粮堆不同深度发生的霉变(距粮面1,2m),监测点设在粮面下3m可减少外界气体交换的影响,监测效果优于深度为1m的监测点。CO_2气体检测过程中,高的取样气流速度可显著降低检测值;对于各种规格的输气管道,适宜的检测气体取样量为管道内部理论体积的1.5倍。通过合理设定参数,CO_2法可灵敏地监测储粮霉菌活动。     

小麦储藏期间霉菌早期活动的快速监测*

将小麦置于不同温、湿度组合条件下进行模拟储藏,利用快速测定微生物活性值(基于过氧化氢酶活性)的方法监测小麦中霉菌的早期活动状态。结果表明,小麦储藏在70%~79%相对湿度条件下49 d,各试验组微生物活性检测的最大值为306 u;当储藏的相对湿度超过80%时,28℃试验组小麦储藏14 d后的微生物活性检测值即大于500 u。分析微生物活性值与小麦品质的关系表明,当检测值达到400 u时,检验发现小麦的品质有轻微劣变迹象。进一步研究还发现,小麦在各种环境条件下储藏的微生物活性变化与储藏时间有较好的线性关系,其线性相关性系数均达0.9或更高。因此,利用监测微生物活性值变化的方法可以对小麦储藏期间霉菌活动危害做出早期预警。     

临界安全水分下小麦储藏过程中抗霉变特性的比较

将3种角质化率有显著差异的小麦品种增水调节至临界安全水分附近进行模拟储藏试验,结果表明,这几种小麦在水分13.5%、30℃条件下储藏28 d后,小麦籽粒上霉菌含量的增速存在较大差异,冀麦38和矮抗58的带菌量增加速率均非常显著地高于温麦6(p<0.01)。进一步的研究证明,温麦6对灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)的生长有明显的抑制作用,在30℃、25℃、20℃和15℃的各种温度和相应的临界水分下进行储藏试验,温麦6中的灰绿曲霉生长迟后时间均达到或超过7 d;将干燥小麦置于RH 85%高湿环境下进行吸湿模拟储藏,温麦6中的灰绿曲霉生长迟后时间达14 d。因而,质地偏软的温麦6在相同的储藏条件下具有更强的抗霉变特性。     

真菌及昆虫在储藏小麦中生长产生CO_2气体的特点

在各种温、湿度条件下对小麦储藏期间真菌和昆虫活动产生二氧化碳气体(CO2)进行监测,研究可用于判断小麦储藏安全性的方法。试验结果表明,储粮温度对处于生长状态的真菌产CO2速率影响最大,从20℃升高到25℃,产CO2速率可提高10倍。在安全水分小麦中,昆虫是产CO2的主要类群,对高水分小麦,真菌是产CO2的主体。在产CO2特性方面,昆虫密度与产CO2量具线性关系(r0.99),而真菌产CO2呈明显的加速现象,在储藏初期带菌量没有显著增加(p0.05)时,产气速率已提高5.96倍。在大型粮仓储藏中的试验也表明,昆虫的产气量恒定,粮堆4 m深度昆虫活动部位25 d的CO2浓度变化幅度为13%,而离霉变点0.5 m的CO2浓度变化高达37倍。因此,利用检测CO2气体浓度变化的方法可以灵敏地发现小麦储藏中昆虫和真菌的危害活动。     

基于监测过氧化氢酶活性对储藏玉米AFB1污染的早期预警

早期预警是防控储藏玉米污染黄曲霉毒素B1(AFB_1)的重要手段。将不同含水量的玉米置于各种温度环境下进行储藏试验,研究过氧化氢酶活性变化与玉米污染黄曲霉毒素B1(AFB_1)的关系,结果表明,两者数据变化的趋势一致,AFB_1是过氧化氢酶活性的二次曲线函数(相关性系数大于0.95)。储藏温度和玉米含水量等条件可改变所含霉菌产生AFB_1和升高过氧化氢酶活性的速度,但不影响数值变化的趋势。在各种储藏条件下,过氧化氢酶活性变化可比玉米中AFB_1含量显著变化的起始点提前4~21d。因此,借助检测过氧化氢酶活性的方法可以早期预警储藏玉米污染AFB_1。     

小麦和玉米中微生物污染和生长的快速检测

为了快速检测粮食及加工品中真菌、细菌等微生物的污染及生长的状况,选用了过氧化氢酶活性检测与经典的平板菌落计数检测进行比对试验。结果表明,对灰绿曲霉菌(Aspergillus glaucus)、黄曲霉菌(Aspergillus flavus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilits)等与粮食及加工品的储藏和流通品质及安全性密切相关的菌种进行梯度稀释菌悬液检测时,过氧化氢酶法检测值的相对偏差较小,且线性相关性系数均达到或大于0.99,其检测值与平板菌落计数法检测值的相关性系数均大于0.95。对于不同微生物污染程度的粮食及加工品,两种方法的检测数值变化趋势完全一致。相对于同一带菌量的样品,当粮食或加工品中的微生物处于生长状态时,过氧化氢酶检测法显示出更高的检测灵敏度,酶活性检测值超过微生物非生长态下同一带菌量样品检测值2倍以上。因此,过氧化氢酶检测法可以作为检测粮食及加工品中微生物污染及生长状况的有效手段。     

利用监测CO_2方法预警储藏玉米中黄曲霉菌产毒

本文研究了玉米储藏期间真菌产生二氧化碳(CO2)气体的特点,试验结果表明,当灰绿曲霉等干生性真菌生长时,储藏容器中CO2浓度恒速升高;具有快速生长或产毒特点的真菌生长时则出现CO2产气率加速的过程,如玉米中以黄曲霉菌为优势菌时,储藏10 d后产生CO2气体的速率提高4.6倍。进一步研究玉米储藏期间不同原始优势菌、不同真菌生长速率及温度对产生CO2的影响,结果表明,在不同原始优势菌的玉米中均可出现黄曲霉菌的生长和产毒,黄曲霉菌为原始优势菌的AFB1产生量比其他试验组高3~7倍,它们均表现产气速率加速的特征;真菌生长速率及温度可影响储藏玉米中CO2和AFB1的产生量,但在产生AFB1的玉米中,均有CO2产气速率加速的现象。将储藏玉米中CO2产气速率变化与检出AFB1的时间相比,发现前者可提前7 d以上。因此,利用玉米储藏中真菌产生CO2的特征可预警黄曲霉毒素的污染。     

利用CO_2检测法监测大型粮仓储粮的虫霉危害

在装粮高度为6 m的大型粮仓中进行粮堆内CO2气体浓度监测试验,研究小麦自身呼吸及昆虫和霉菌活动产生CO2气体的特点.结果表明,安全水分小麦呼吸水平较低,6个月中检测的CO2浓度最高值仅为0.06%.昆虫活动可显著提高粮堆中的CO2气体浓度,4头/kg昆虫可使粮堆下层的CO2气体浓度升高至2%以上.在粮堆中埋设20 kg水分20%以上的小麦作为模拟霉变品,监测霉菌活动产生的CO2气体浓度,结果发现,1 d后距霉变点上下0.5 m的部位CO2气体浓度分别升高了4.3和3.0倍,3 d后距霉变点水平距离2 m的部位CO2气体浓度升高了2.9倍;与粮堆测温方法相比,当模拟霉变点的温度随着霉菌的活动升高16℃时,水平相距1 m和2m的部位未检测到温度的显著变化(p>0.05).因此,在粮仓中采用测定CO2气体的方法监测虫霉活动可显著提高监测灵敏度.