β-甘露聚糖酶AuMan5Aloop/H321G在乳酸克鲁维酵母中的高效表达

为制备食品级β-甘露聚糖酶,将来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)的糖苷水解酶5家族β-甘露聚糖酶突变体基因(AuMan5A~(loop/H321G))克隆至表达质粒pKLAC1信号肽α-MF下游,构建重组表达质粒pKLAC1-AuMan5A~(loop/H321G),并电转化乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)GG799。采用半乳糖诱导表达和酶活性分析获得了高水平表达的重组β-甘露聚糖酶突变酶(reAuMan5A~(loop/H321G))的转化子GG799/AuMan5A~(loop/H321G),其产酶活力为54.9 U/mL。SDS-PAGE分析显示,reAuMan5A~(loop/H321G)的表观相对分子质量约为55 000。经YPG培养基初始pH、摇瓶装液量以及诱导剂的种类、初始质量浓度和添加方式的初步优化,GG799/AuMan5A~(loop/H321G)所产酶活力较工艺优化前提高了254.6%,从而实现了reAuMan5A~(loop/H321G)在乳酸克鲁维酵母中的高效表达。     

CBM融合位置对AuMan5A酶学性质的影响

为探讨碳水化合物结合结构域(CBM)不同融合位置对Aspergillus usamii 5家族β-甘露聚糖酶AuMan5A酶学性质的影响,将Thermotoga maritima 27家族CBM分别融合至其C和N末端,构建出融合酶基因Auman5A-cbm27和cbm27-Auman5A。将Auman5A和融合酶基因分别在Pichia pastoris GS115中表达,分析比较表达产物AuMan5A、AuMan5A-CBM27和CBM27-AuMan5A的酶学性质。结果表明:AuMan5A、AuMan5A-CBM27和CBM27-AuMan5A的最适温度Topt分别为70、70℃和60℃;其中AuMan5A-CBM27在68℃及以下保温1 h残余酶活均大于85%,与原酶相比,其热稳定性提高了约8℃,而CBM27-AuMan5A在58℃及以下保持稳定,与原酶相比,降低了2℃。3种酶的最适pH均为4.0;AuMan5A在pH值2.5～7.5范围内保持稳定,2种融合酶在pH 2.0～9.0内均能保持稳定。与AuMan5A相比,AuMan5A-CBM27和CBM27-AuMan5A对角豆胶的Km分别降低了45.0%和26.3%。通过比较3种酶的酶学性质,证实CBM不同融合位置对AuMan5A酶学性质具有重要影响。     

氧化三酰甘油聚合物的细胞毒性研究

食用植物油经深度氧化劣败会产生高浓度的氧化三酰甘油聚合物(TGP),TGP是氧化三酰甘油(oxidized triacylglycerol,ox-TG)的二聚体(oxidized triacylglycerol dimers,TGD)和寡聚体(oxidized triacylglycerol oligomers,TGO)的总称。研究旨在初步评价TGD和TGO的生物学毒性。以不同浓度的TGP作用于体外培养的巨噬细胞,分别检测细胞的增殖能力、中性红吞噬能力和LDH释放量,同时采用激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡、流式细胞术检测细胞内ROS水平。结果显示,TGP显著抑制巨噬细胞的增殖能力和中性红吞噬能力,显著提高细胞内ROS水平和LDH释放量,导致巨噬细胞的凋亡。因此,初步证实TGP具有明显的生物学毒性,对机体的免疫功能有损伤作用。     

不对称还原苯丙酮酸的L-乳酸脱氢酶L-LcLDH2的表达及生物信息学分析

以干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增一种L-乳酸脱氢酶(L-Lc LDH2)的编码基因Lcldh2;借助表达质粒pET-28a(+)将Lcldh2在大肠杆菌BL21(DE3)中实施异源表达。实验结果表明,细胞超声破碎液中L-Lc LDH2催化苯丙酮酸的酶活性为47 U/mg总蛋白质;采用重组E. coli/Lcldh2全细胞催化苯丙酮酸还原,所获产物L-苯乳酸的对映体过量(eep)值 99%。生物信息学分析表明,Lcldh2开放阅读框长906 bp,编码含301个氨基酸的L-Lc LDH2,预测其相对分子质量和等电点分别为32 585和5.5;L-Lc LDH2含有典型的NAD+结合位点序列(GXGXXG),属于NAD依赖型L-乳酸脱氢酶,且是一种非分泌、非跨膜、无信号肽和定位于细胞质的酶蛋白。L-Lc LDH2的获得为生物法制备高光学纯L-苯乳酸提供了新的酶源。